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研究背景:脓毒症(Sepsis)是机体由感染所引发的全身炎症反应综合征。肺脏是脓毒症时最易受损伤的靶器官,急性肺损伤(acute lung injury,ALI)在脓毒症时出现最早,且发生率最高。炎性介质的大量释放可致肺泡上皮细胞及血管内皮细胞受损、通透性增加,同时血液中的蛋白质及液体快速进入肺组织,形成渗透性肺水肿。作为主要的炎症介质之一,高迁移率组蛋白1(high mobility group protein,HMGB1)与晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)结合激活下游信号通路从而参与晚期炎症反应。哺乳动物成蛋白1(mammalian diaphanous 1,mDia1)的FH1段可以与RAGE胞浆段结合,应用mDia1基因敲除的细胞能够使RAGE配体介导的一系列信号通路受到抑制。早期的对由HMGB1与RAGE介导的信号通路的研究中就曾指出上述两者结合后能通过细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42,Cdc42)与Rac1来调控细胞骨架的运动以及细胞的迁移。本研究进一步探讨了 RAGE,mDia1和Cdc42是否参与HMGB1介导的肺癌上皮细胞(Lung cancer cells,A549 cells)通透性增高中的作用。实验室前期工作已经证实角蛋白7(keratin 7,Krt 7)的表达在脓毒症休克小鼠肺脏组织中具有差异表达。Krt7是上皮细胞骨架蛋白,与上皮细胞屏障功能紊乱密切相关。据此我们推测,Krt7参与脓毒症休克小鼠所致急性肺损伤肺泡上皮细胞通透性增高中的作用。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)参与调控角蛋白磷酸化,直接磷酸化Krt8的第73位丝氨酸,Krt7和Krt8同为角蛋白家族,因此我们假设p38 MAPK参与Krt7磷酸化水平的调控。研究表明,Ⅱ型角蛋白5(Krt5)与上皮细胞间连接蛋白桥粒形成角蛋白-桥粒复合物,其稳定性在伤口愈合和表皮屏障功能起重大作用。Krt7是Ⅱ型角蛋白,在肺脏上皮细胞高表达,我们推测Krt7与桥粒蛋白参与调节上皮细胞屏障功能。研究目的:本研究旨在阐明RAGE和Krt7是否参与HMGB1介导的肺上皮细胞通透性增高,并探讨其具体机制。方法:采用原代分离培养小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞、肺癌上皮细胞A549培养技术,用免疫印迹、免疫荧光、siRNA干扰、转染质粒、腺病毒、跨上皮细胞电阻(TER)和FITC标记的右旋糖酐检测通透性等方法,观察RAGE和Krt7在HMGB1介导的肺泡上皮细胞通透性增高中的作用。结果:1.RAGE基因缺失对CLP脓毒症小鼠模型所致急性肺损伤有保护作用。WT-CLP组的肺的含水量、肺泡灌洗液的中性粒细胞数和总蛋白浓度、肺泡灌洗液和血清中的HMGB1的含量均高于WT-Sham组;WT-CLP组肺脏的病理切片,多个大小不等的肺泡腔,间质明显充血、水肿,大量炎症细胞及红细胞浸润。RAGE(-/-)-CLP组和RAGE(-/-)-Sham组比较各项指标均无明显变化。2.mDia1与RAGE结合参与HMGB1介导A549细胞通透性增高。给予HMGB1 100 ng/mL刺激6h,与不加刺激组相比,HMGB1组TER显著下降,FITC-dextran漏出显著增多。与HMGB1组相比,转染RAGE siRNA、转染mDia1 siRNA和感染mDia1干扰腺病毒、转染突变RAGE与mDia1的结合位点的质粒组TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少;转染RAGE野生型质粒组TER下降幅度明显增大,FITC-dextran漏出显著增多,对照siRNA组、对照腺病毒组及空载质粒组则无明显改变。3.Krt7参与HMGB1介导的A549细胞通透性增高。与HMGB1组相比,转染Krt7 siRNA组TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少,对照siRNA组则无明显改变。4.HMGB1诱导p38 MAPK的磷酸化水平增加;HMGB1通过Cdc42-p38 MAPK介导A549细胞通透性增高的作用。Cdc42抑制剂ML141预处理,HMGB1介导p38 MAPK的磷酸化受到抑制,TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少。HMGB1介导p38 MAPK的磷酸化在30min达到峰值;与HMGB1组相比,转染p38 MAPK siRNA组TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少,对照siRNA组则无明显改变。p38 MAPK抑制剂SB203580预处理组,TER下降幅度明显降低、FITC-dextran漏出明显减少。5.p38 MAPK参与调控Krt7的磷酸化。HMGB1 100 ng/mL刺激A549细胞30min,免疫共沉淀p38 MAPK,IB结果显示Krt7含量增加;免疫共沉淀Krt7,IB结果显示p38 MAPK含量增加。体外GST-pull down实验,Western Blot检测证明p38 MAPK与Krt7可以互相结合。p38 MAPK上游激酶MKK6(b)激活型腺病毒(MKK6(b)E)预处理A549细胞,WB检测Krt7同分子量位置磷酸化丝氨酸表达有明显增加。利用生物信息学分析软件GPS 3.0在线分析工具,对Krt7的蛋白序列进行磷酸化位点预测,找到p38 MAPK参与调控Krt7的磷酸化的特殊位点。6.原代肺泡Ⅱ型上皮细胞Krt7均匀分布于细胞浆,细胞间连接紧密,边缘光滑,无明显缝隙;HMGB1刺激后Krt7在胞浆中呈簇状分布,胞质可见网状物,细胞边缘有丝状突起;正常对照组的上皮细胞桥粒蛋白Desmoplakin、Desmoglein3边界清晰,细胞间连接紧密,无明显缝隙;刺激后,Desmoplakin、Desmoglein3边界模糊,成不连续状。结论:1.RAGE参与CLP致小鼠急性肺损伤的过程;RAGE参与HMGB1介导的A549细胞通透性增高。2.mDia1与RAGE结合参与HMGB1介导A549细胞通透性增高。3.HMGB1诱导p38 MAPK的磷酸化水平增加,HMGB1通过Cdc42-p38 MAPK介导A549细胞通透性增高。4.Krt7参与HMGB1介导的A549细胞通透性增高,初步验证了 p38 MAPK可参与调控Krt7的磷酸化。5.HMGB1可以介导上皮细胞Krt7、Desmoplakin、Desmoglein3形态结构改变。