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金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要病原菌之一,其在穿过奶牛乳头到达奶牛乳腺后首先与奶牛乳腺上皮细胞接触。研究发现,金黄色葡萄球菌诱导宿主细胞凋亡主要与致病菌的毒力因子有关,PV-杀白细胞素(PVIL)是金黄色葡萄球菌分泌的主要细胞外毒素。近年来,在奶牛乳腺炎中pvl检出率不断升高,说明其编码的毒素PVL在奶牛乳腺炎中扮演了很重要的角色,但关于PVL在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞过程中作用的研究还没有报道。此外,研究发现金黄色葡萄球菌的毒力因子能够导致更严重的感染,因此寻找药物靶向干预金黄色葡萄球菌毒力因子是非常有效的措施。在抗毒力治疗研究中发现苦参碱和黄芩苷能够明显抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素的分泌和活性,并且在金黄色葡萄球菌性乳腺炎治疗过程中有很好的作用。因此,本研究通过探讨金黄色葡萄球菌ATCC49775、△pvl49775和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用,分析苦参碱和黄芩苷干预rPVL损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制,为研究苦参碱和黄芩苷对细菌及其毒力因子作用机制奠定基础。本研究通过构建金黄色葡萄球菌LukS-PV和LukF-PV重组表达载体并分别转化大肠杆菌BL21,实现了 LukS-PV和LukF-PV蛋白体外表达和纯化;在体外培养奶牛乳腺上皮细胞,分别研究了产PVL金黄色葡萄球菌ATCC49775、△pvl49775和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用;分析苦参碱和黄芩苷体外抑菌效果以及对金黄色葡萄球菌分泌PVL的影响,以及苦参碱和黄芩苷干预PVL损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制。实验发现,ATCC49775pvl基因缺失后菌株增殖活性降低,但不影响其溶血活性,药敏试验结果显示pvl缺失使得菌株对抗生素更加敏感;表达纯化后获得的LukS-PV浓度为0.6 mg/ml,LuκF-PV浓度为1.15 mg/ml;苦参碱对ATCC49775和△pvl49775的最小抑菌浓度分别为10mg/ml、5mg/ml,黄芩苷对ATCC49775和△pvl49775的最小抑菌浓度分别为1mg/ml、0.0625mg/ml,两药联合使用对ATCC49775表现为协同,对△pvl49775表现为无关;黄芩苷在使用浓度内(2.5-10μg/mL)能抑制金黄色葡萄球菌生长,黄芩苷显著抑制金黄色葡萄球菌二元调控系统中RNAⅢ的表达(P<0.01);苦参碱在使用浓度内(25-100μg/mL)能抑制LukS-PV蛋白分泌,并呈浓度依赖性;金黄色葡萄球菌ATCC49775和△pvl49775粘附、入侵奶牛乳腺上皮细胞的能力无显著差异,黄芩苷在使用浓度内显著抑制金黄色葡萄球菌粘附、入侵奶牛乳腺上皮细胞(P<0.01);金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞发现ATCC49775诱导的细胞凋亡率高于△pvl49775(P<0.05),苦参碱和黄芩苷在使用浓度内均显著抑制金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡(P<0.01);金黄色葡萄球菌 rPVL 能够上调 cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 的表达诱导奶牛乳腺上皮细胞发生凋亡(P<0.01),苦参碱和黄芩苷在使用浓度内均能下调rPVL诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡(P<0.01),黄芩苷能够下调cleavedcaspase-9的表达(P<0.01),苦参碱能够下调 cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 的表达(P<0.01)。结果表明,苦参碱和黄芩苷在体外能够抑制产PVL金黄色葡萄球菌ATCC49775,两者联合使用对产PVL金黄色葡萄球菌表现为协同作用;苦参碱能够抑制金黄色葡萄球菌分泌LukS-PV的水平,Westerm Blot检测发现这种抑制机制发生在LukS-PV的蛋白表达方面,RT-qPCR检测发现苦参碱和黄芩苷对LukS-PV基因的转录水平没有影响;黄芩苷对金黄色葡萄球菌分泌LukS-PV无影响,但是能够抑制二元调控系统中RNAⅢ的转录水平,进而抑制其他毒力因子的表达。用金黄色葡萄球菌ATCC49775和△pvl49775感染奶牛乳腺上皮细胞发现pvl基因缺失不影响其粘附、入侵奶牛乳腺上皮细胞的能力;通过流式细胞术检测到ATCC49775诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡和坏死比△pvl49775强;研究发现,苦参碱和黄芩苷在使用浓度内均能抑制金黄色葡萄球菌粘附、入侵奶牛乳腺上皮细胞;苦参碱和黄芩苷在使用浓度内均能抑制金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤。用体外重组PVL作用奶牛乳腺上皮细胞后发现细胞凋亡过程中死亡受体途径和线粒体途径都有参与;药物干预后发现黄芩苷通过下调线粒体途径中cleaved caspase-9的表达干预PVL诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡;苦参碱通过下调死亡受体途径和线粒体途径中cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达干预PVL诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡。