鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)引起的人畜共患烈性传染病,人间鼠疫包括肺鼠疫和腺鼠疫,腺鼠疫是通过跳蚤叮咬感染,Y.pestis迁移到肺部就会引起肺鼠疫感染,肺鼠疫能够通过气溶胶在人与人之间传播,在不予治疗的情况下死亡率高达100%。目前鼠疫仍是一个重要的公共卫生问题,世界上每年还有上千感染病例,主要分布在非洲、亚洲和南美洲。由于传统的鼠疫疫苗存在对肺鼠疫无效、副反应强烈等缺陷,至今世界还没有一种值得推广的鼠疫疫苗。一种理想的鼠疫疫苗应具备成本低、热稳定、能通过黏膜简便方法接种、能同时刺激机体产生体液和细胞免疫应答等特点,基于肺鼠疫的感染特点,激发黏膜免疫反应是预防肺鼠疫的研究重点。Y.pestis能产生很多由染色体或质粒编码的毒力因子,包括pgm、pst、Yops、F1抗原及V抗原等,由于这些毒力因子的致病作用机制尚不清楚,很难确定候选疫苗的组分。然而,诸多研究发现,F1和V抗原是鼠疫两大主要保护性抗原,也是鼠疫新型疫苗研究的重点。本研究就是以F1和V抗原为材料,进行鼠疫新型疫苗的探索,主要内容包括:1.从Y.pestis EV76株的质粒中钓取编码F1和V抗原的基因片段,并将二者融合克隆到原核表达载体pET11c上,转入宿主菌E. coli BL21,用IPTG诱导表达重组融合蛋白rF1-V,纯化后加入氢氧化铝佐剂制备鼠疫候选亚单位疫苗。2.将编码F1-V融合蛋白的基因,克隆到原核表达载体asd-pTrc99A,转入asd-大肠杆菌X6097,用电击转化经减毒沙门氏菌中间宿主asd- X3730转入减毒沙门氏菌终末宿主asd- X4072得到重组菌X4072(F1-V/99A),将菌体裂解液做Western-blot鉴定表达的F1-V融合蛋白。从而构建出稳定表达F1-V融合抗原的减毒沙门氏菌X4072(F1-V/99A),作为鼠疫口服疫苗候选株。3.以小鼠为动物模型进行鼠疫候选DNA疫苗(裸质粒F1-V/pVAX1)的安全性检测,通过接种动物的大体观察和称重等方法,进行急性毒性和长期毒性试验;提取组织DNA,通过PCR方法,检测质粒F1-V/pVAX1在小鼠组织的分布和滞留时间;用ELISA和ELISPOT方法进行抗核抗体检测。初步验证裸质粒F1-V/pVAX1的安全性,为下一步口服活载体DNA疫苗的研究提供依据。4.将编码F1-V融合抗原的基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,转入asd-大肠杆菌X6212,再依次将重组质粒转化asd-减毒沙门氏菌X3730、X4550,得到重组减毒沙门氏菌X4550(F1-V/AP),提取重组质粒转染COS-7细胞,用免疫组化和Western-blot