糖苷酶能以糖基供体和糖基受体一步合成糖苷产物,反应途径简单,底物价格便宜,广泛应用于酶促糖苷化反应,但糖苷酶催化的反应中,部分反应产物可以作为酶底物被重新水解,导致产物产量不高。近年来糖苷酶的分子改造研究大幅提高了糖苷酶的转苷效率,使得糖苷酶真正成为糖苷合成的有力工具。α-半乳糖苷酶是一类重要的糖苷酶,催化α-半乳糖苷键发生水解,某些种类的α-半乳糖苷酶在水解α-半乳糖苷键的同时,还具有转半乳糖基活性,可用于合成α-低聚半乳糖和α-半乳糖苷化合物,应用于食品保健及医药业等。该类酶转糖基合成的键型以Galα1-3和Galα1-6键型为主,仅有本课题组报道的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) 203和一种植物来源的α-半乳糖苷酶能够催化合成Galα1-4键型。Galα1-4存在于重要的细胞表面糖链如志贺毒素受体Gb3糖链(globotriose,Galα1-4Galβ1-4Glc)及肿瘤细胞表面抗原Globo-H中,体外获得该类糖链有利于研发抗菌药物及肿瘤疫苗,因而具有Galα1-4区域选择性的α-半乳糖苷酶在合成寡糖药物方面具有重要的应用价值。α-半乳糖苷酶催化的糖苷合成反应遵循糖苷酶的一般作用机制,产物产量不高。目前国际上分子改造α-半乳糖苷酶提高转苷活性的研究已经开展,但仅有4例在分析酶蛋白结构的基础上进行定点突变获得了高效转糖基酶的报道,通过随机突变提高α-半乳糖苷酶转糖基活性的研究未见报道。虽然已发现了两种α-半乳糖苷酶能合成Galα1-4键,但尚未应用于合成Galα1-4寡糖药物如globotriose或其衍生物。另一方面,某些糖苷酶在催化转糖基活性时,其区域选择性会因受体结构的改变而发生变化,本论文研究发现了 B. breve 203 α-半乳糖苷酶对不同糖基受体的区域选择性存在差异,但目前尚无文献报道解释糖苷酶转糖基区域选择性的分子机理,已有的α-半乳糖苷酶的晶体结构研究主要集中在水解性质的研究。基于此,本论文首次通过随机突变的方式对B. breve 203 α-半乳糖苷酶进行分子改造,获得了高效转苷酶,并应用该酶合成了 globotriose衍生物,填补了国际上糖苷酶法合成globotriose衍生物的空白,同时研究了该酶以多种受体分子进行转糖基的区域选择性,探索了该酶的结晶条件,为进一步获得高质量单晶用于解释高效突变酶转苷效率提高的结构因素以及酶转糖基区域选择性的分子机理奠定了基础。前期工作中,从B.breve 203中纯化出α-半乳糖苷酶Aga2,其N-端氨基酸序列为A-I-M-D-F-H-G,该酶具有转糖基活性。通过分析不同菌株α-半乳糖苷酶基因的同源性,扩增B.breve 203 α-半乳糖苷酶基因保守区,将其制成探针进行Southern杂交,首次获得B.breve 203 α-半乳糖苷酶基因aga2,基因大小为2226 bp,编码741个氨基酸,理论分子量约为81.5 kDa。该基因的GenBank登录号为DQ267828。用pET-22b将aga2基因在大肠杆菌中进行了异源表达,重组酶Aga2性质与纯化酶Aga2基本一致。单亚基分子量约为80.5 kDa,与由核苷酸序列推测的蛋白理论分子量基本一致,活性状态分子量约为152 kDa,是一个双亚基蛋白。除水解活性外,该酶以蜜二糖(Galα1-6Glc)为底物时能够催化转糖基反应合成新型寡糖Galα1-4Galα1-6Glc。本论文首先对B.breve 203 α-半乳糖苷酶Aga2进行了随机突变的分子改造。采用易错PCR对基因aga2进行随机突变,通过X-α-Gal平板蓝白斑初筛水解活性和TLC复筛转糖基活性,从约4000个重组子中筛选获得了两个转糖基活性高于原始重组酶Aga2的突变酶RM70和RM103,以蜜二糖为底物的转糖基效率分别为45% (RM103)和47% (RM70),均比原始重组Aga2 (26%)高出了约20个百分点。突变酶RM70和RM103均能高效表达为可溶性蛋白,存在的突变位点未影响蛋白质的正确折叠。基因测序显示RM70中存在3个突变位点G218S,D457A和H729R,RM103中存在2个突变位点V564E和H573L。通过定点突变构建了上述5个突变位点的单位点突变酶,分析这5种突变酶以蜜二糖为底物的转糖基效率,发现氨基酸V564、H573和H729在提高Aga2转糖基活性中发挥着正向作用。通过定点突变将氨基酸V564、H573和H729分别突变为不同类型的氨基酸(I/V、S、M、N、D、R/K、Y、W和H),并分析相应突变酶以蜜二糖为受体的转糖基效率,发现氨基酸V564对Aga2转糖基活性的提高发挥着至关重要的作用,将其从缬氨酸突变为天冬酰胺后(V564N),转糖基效率大大提高,由原始重组Aga2的26%提高至58%。原始酶Aga2和突变酶V564N、H573N以及H729S的三维模拟结构显示,突变酶V564N的催化腔洞相比原始酶变得更浅更宽,可能使底物或转糖基产物更容易进入反应洞穴或更容易与酶脱离进而提高转糖基活性;氨基酸位点573的氨基酸由原始酶的组氨酸突变为天冬酰胺后,更容易与水分子形成H-键,可能通过在催化腔洞外捕获水分子而降低催化中心水活度,进而提高转糖基活性;氨基酸位点729位于远离催化结构域的C端结构域上,其提高转糖基活性的原因尚不清楚。研究了上述高效转糖基突变酶以对硝基苯半乳糖苷为糖基供体、乳糖或乳糖衍生物为糖基受体合成globotriose或其衍生物的转糖基反应。在以乳糖为受体的转糖基反应中催化合成 Ga l α1-3Galβ1-4Glc、Galβ1-4(Galα1-6)Glcα 和Galα1-6Galβ1-4Glc三种寡糖,未检测到目标产物globotriose,但产生了另一种重要的药用寡糖α-Gal抗原寡糖。重点对以甲基乳糖为受体的转糖基反应进行了研究,此反应中通过一步反应同时合成了 α-Gal抗原和globotriose衍生物两类重要药用寡糖。原始重组酶Aga2和突变酶RM70、RM103、V564N、H573N和H729S以甲基乳糖为受体催化的转糖基反应产生相同的产物,均出现两个转糖基产物。突变酶RM70催化转糖基产物的总产率(28%)与原始酶(28%)相同,突变酶RM103、H573N和H729S提高的幅度较小,仅提高了 3%-5%,突变酶V564N提高的幅度最大,比原始酶高出10%。因此选用突变酶V564N用于后续的扩大反应,研究了反应条件对转糖基产物产率的影响,在反应温度25℃-40℃以及pH 6.5-8.5范围内,转糖基产物产量变化不大,反应10分钟转糖基产物产率即能达到最大值,随后产率保持不变,稳定在最高值。与原始重组酶Aga2相比,突变酶V564N表现出不水解转糖基产物的性质。将转糖基产物通过HPLC法进行分离纯化,通过质谱和NMR (1H、13C、COSY、HMBC和HSQC)鉴定转糖基产物结构为 Galα1-3Galβ1-4GlcβOMe 和 Galα1-4Galβ1-4GlcβOMe。该研究首次通过酶法反应一步获得两种重要的Galα1-3和Galα1-4键型寡糖,并且α-半乳糖苷酶合成globotriose衍生的能力为国际上首次发现。进一步研究表明,B. breve 203 α-半乳糖苷酶具有广泛的糖基受体选择性,由于突变酶V564N具有更高的转苷效率,并且突变酶V564N与原始酶转糖基区域选择性一致,因而选择突变酶V564N研究了酶对各种不同糖基受体的区域选择性。以对硝基苯半乳糖苷为糖基供体,以葡二糖如海藻糖(Galα1-1Glcα)、曲二糖(Galα1-2Glc)、黑曲霉糖(Galα1-3Glc)、麦芽糖(Galα1-4Glc)、异麦芽糖(Galα1-6Glc)、槐糖(Galβ1-2Glc)、昆布二糖(Galβ1-3Glc)、纤维二糖(Galβ1-4Glc)和龙胆二糖(Galβ1-6Glc)为糖基受体建立转糖基反应,结果发现所有反应均有新的转糖基产物生成。突变酶V564N在以空间位阻较大的分子为受体时,如α-构型连接的葡二糖(海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖)和龙胆二糖,转糖基区域选择性专一,只催化单一产物的产生;在以空间位阻较小的分子为受体时,如β-构型连接的葡二糖(槐糖、昆布二糖、纤维二糖),转糖基区域选择性多样,催化多种同分异构体的合成,以槐糖为受体时,有一个主产物和两个同分异构体副产物;以纤维二糖为受体,有两个含量相当的主产物和一个副产物。对以葡二糖海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、纤维二糖和龙胆二糖为受体的转糖基主要产物通过质谱和NMR(1H、13C、COSY、HMBC和HSQC)进行结构鉴定,产物结构分别为Galα 1 -6Glcα 1-1 Glcα 、 Glcα1 -2(Galα1 -6)Glcβ 、 Galα1 -6Glcα1 -3Glc 、Galα1 -6Glcα1 -4Glc 、 Galα 1 -6Glcα1 -6Glcβ、 Galα1-6Glcβ1-2Glcα 、Gala1-6Glcβ1-3Glcα、Galα1-6Glcβ1-4Glcβ和 Galα1-6Glcβ1-6Glc。其中,以海藻糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、纤维二糖和龙胆二糖为受体时合成直链型Galα1-6键型寡糖为单一产物或主要产物,而以曲二糖为受体的转糖基反应只合成支链型的Galα1-6键产物。这与该酶以蜜二糖或甲基乳糖为受体转糖基的区域选择性完全不同,酶对不同受体表现区域选择性的分子机理尚不清楚。对B.breve 203 α-半乳糖苷酶Aga2的蛋白质晶体生长进行了探索,期望获得高质量单晶,用于结构解析,阐释高效突变酶转苷效率提高以及该酶转糖基区域选择性的分子机理。通过镍亲和层析、Source 15Q阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析纯化获得了纯度和均一性满足蛋白质结晶的要求的Aga2蛋白质。利用 Crystal screen、Crystal screen Ⅰ、Index 1-96、Natrix、SaltRx、PEGRx-1、PEGRx-2、PEG ion-1、PEG ion-2、Wizard Ⅰ、WizardⅡ、WizardⅢ共 14 个试剂盒对Aga2蛋白质的晶体生长条件进行普筛,获得一个用于蛋白质晶体生长的条件 PEGRx-2 33 (4% 2-propanol、0.1 M Bis-Tris pH 9.0、20% PEG monomethyl ethero 5000),在此基础上通过矩阵法、改变晶体生长温度、种晶以及添加additive和detergent等手段对Aga2蛋白质晶体生长条件进行优化,最终在结晶条件为4%v/v 2-propanol、0.1 M Bis-Tris propane pH 8.95、21% PEG 5000、添加 detergent试剂ANAPOE(?)-X-114、蛋白质浓度为9 mg、4℃生长时获得可用于X-ray衍射的蛋白质晶体。该蛋白质晶体的分辨率为3.2 A,空间群为P212121,但由于晶体分辨率低和已知数据库中蛋白质的同源性低,未能解析出Aga2蛋白质的相角问题。进一步通过硒代培养基将Aga2中的甲硫氨酸替换为硒代甲硫氨酸,希望通过多波长反常散射法解决蛋白质的相角问题,硒代Aga2经纯化后按Aga2蛋白质晶体生长条件PEGRx-2 33进行生长,经过矩阵法优化晶体生长条件后获得分辨率为2.8 A的蛋白质晶体,但硒代后的蛋白质晶格排列不正确,无法对蛋白质结构进行解析。目前正在进一步对硒代Aga2蛋白质晶体生长条件进行优化,同时尝试对蛋白质自身进行修饰(如截短蛋白),期望最终获得高质量蛋白质晶体用于结构解析。