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目的：随着老龄化社会的到来，神经退行性疾病的发病率越来越高，早老性痴呆、帕金森等常见的神经系统疾病越来越受到社会和全世界的广泛关注，以干细胞为代表的神经再生医学的崛起为神经系统病变的治疗提供了新的思路和平台。脐带中的间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。其与成体干细胞相比，具有更强的增殖分化能力。在特定的体内外环境下，脐带间充质干细胞能够被诱导分化成为多种组织细胞，是目前用于干细胞治疗的干细胞来源之一。而干细胞的定向诱导分化更是研究的重点。本试验研究大鼠大脑皮层匀浆对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）诱导分化的影响。从形态学上观察诱导后的细胞是否具有神经元样特征，用免疫细胞化学法鉴定诱导后的细胞是否有神经元特有的功能酶烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）和GABA能神经元的标志物谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase, GAD）表达。GAD是专一的γ-氨基丁酸合成酶，在其催化下，谷氨酸（glutamate, Glu）脱羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）。GAD可以看作是GABA能神经元的标志物。应用高效液相串联质谱法测定诱导的神经元样细胞中γ-氨基丁酸（GABA）的水平，探讨微环境对脐带间充质干细胞分化的影响及其作用机制。这将为脐带间充质干细胞的临床应用提供更充足的理论依据。方法：1大鼠大脑皮层匀浆的制备取10雄性Sprague Dawley （SD）大鼠，体重200230g，将其分别断头处理后，取出大脑皮层置于冰上，称其湿重。然后在冰上匀浆（150mg/mL DMEM/F12），匀浆后在室温下以3000rmin-1的转速离心15min，取离心后的上清液，经0.22μm滤膜过滤，作为诱导培养液。2hUC-MSCs的正常培养与用大鼠大脑皮层匀浆诱导后的形态观察本实验中所用的干细胞为4-6代，且经流式细胞术鉴定为hUC-MSCs。用胰蛋白酶消化干细胞，将其制成单细胞悬液，调整密度为5×104个/mL，每孔0.5mL接种于24孔细胞培养板中，孔内预先铺有经鼠尾胶原处理的盖玻片，并将其置于37℃，5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，24h后，待细胞贴壁伸展后加入诱导培养液，并以正常培养的hUC-MSCs作对照，密切观察细胞形态变化。3使用免疫细胞化学染色按SABC免疫细胞化学说明书对细胞进行染色。鉴定经大鼠大脑皮层匀浆诱导后的细胞是否表达NSE和GAD-67，推测其是否具有GABA能神经元的特征。4细胞样本的收集与处理将细胞培养板置于冰上，弃去培养液，将贴壁细胞用细胞刮刀收集，将其漂洗干净，离心后收集细胞沉淀，使用细胞超声碎裂仪使细胞裂解，离心收集上清，冷冻保存待测。5用高效液相串联质谱技术测定细胞样品中的GABA本实验分析柱采用ZIC-HILIC柱（3.5μm，2.1mm×50mm，100APEEK HPLC Column德国默克时光公司），流动相为乙腈：水（含0.5%甲酸）=8:2，流速200μL·min-1，正离子ESI源检测，Spray Voltage4.0kV，Sheath Gas Pressure（N2）45psi，选择离子反应监测（SRM）定量分析的离子分别为m/z104→m/z87（GABA）、m/z285→m/z200（morphine）。碰撞能量为10V（GABA）和24V（morphine），扫描时间scan time600ms。本实验建立了一种灵敏、准确和特异性强的检测方法，可以满足待测细胞中GABA的测定需要。结果：1正常培养组hUC-MSCs的形态学特征显微镜下观察hUC-MSCs正常培养组，大部分细胞呈梭型、多角形，细胞折光性好，核仁明显。少量细胞胞体大而扁平，立体感不强。2大脑皮层匀浆诱导后hUC-MSCs的形态学变化显微镜下观察大鼠大脑皮层匀浆液诱导后，hUC-MSCs的分化状态及形态学变化。加入匀浆液培养24h后，即可见大部分hUC-MSCs形态出现明显改变，表现为胞体收缩，变为圆形，突起增多变长，胞体亮度高，折光性变强；48h后，绝大部分细胞由圆形慢慢长成梭形、多边形和不规则形。大部分细胞的形态都已发生了变化，具有了神经元样细胞的特征；72h后，大部分细胞的形态再无明显变化。3诱导分化后细胞的NSE和GAD-67表达诱导hUC-MSCs向神经元细胞分化72h后，免疫细胞化学法检测NSE和GAD-67的表达情况。发现正常培养的hUC-MSCs不表达NSE和GAD-67；大部分诱导后的细胞NSE和GAD-67表达阳性。4GABA测定方法学确证本实验建立了高效液相串联质谱技术测定细胞内γ-氨基丁酸的方法。细胞样品中的GABA在5ng500ng·mL-1范围内具有良好的线性关系，最低定量限（lower limit of quantization, LLOQ）为5ng·mL-1。线性范围、准确度、精密度实验显示本方法适用于诱导后的干细胞中GABA的测定。正常培养的hUC-MSCs样品GABA含量低于最低定量限，皮层组织诱导后的细胞样品中GABA含量均可定量测定。5大脑皮层匀浆诱导对hUC-MSCs分化后细胞内GABA的水平的影响正常培养的hUC-MSCs内GABA的浓度均低于最低定量限。大鼠大脑皮层匀浆诱导0d组细胞内GABA的含量为0ng；3d组细胞内GABA的含量为（48.6±9.6） ng；5d组的含量为（59.4±4.9） ng。7d组的含量分别为（28.6±6.0） ng。与大鼠大脑皮层匀浆诱导3d组比较，诱导7d组细胞中GABA含量降低了51.8%（P<0.05），而5d组细胞中GABA水平则未见显著性改变（P>0.05）。结论：1hUC-MSCs经大鼠大脑皮层匀浆诱导后，细胞形态发生明显改变，并且免疫细胞化学染色结果显示其表达NSE和GAD-67。提示诱导后的细胞在形态结构和分子标志物方面已具有部分GABA能神经元的特征。2经大鼠大脑皮层微环境诱导后，hUC-MSCs分化的细胞内GABA水平显著升高，表明该细胞具有了合成GABA的能力，但其是否为典型的GABA能神经元，仍需要进一步研究证明。