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目的:前列腺癌（prostate cancer,PCa）威胁着全世界上百万男性的健康,在男性肿瘤患者中是仅次于肺癌的第二常见肿瘤疾病,占全球新诊断男性癌症的7%（而在发达地区该比例达到15%）。此外,每年全球有超过120万的PCa新确诊病例和超过35万的PCa相关死亡病例,导致PCa已成为男性癌症相关死亡的主要原因之一。所以PCa的诊断防治始终是人类健康事业中的重要工作。本研究拟通过转录组学数据将PCa患者划分为不同风险等级的亚型,随后利用多组学数据验证并说明不同亚型之间的风险差异。并以此为基础,使用机器学习的方法构建临床预后风险模型并挖掘出潜在研究靶点增殖细胞核抗原钳夹相关因子（proliferating cell nuclear antigen clamp associated factor,PCLAF）。PCLAF 与 DNA 合成、修复以及细胞周期的调控等生物学过程均有关系。并且越来越多的研究发现PCLAF与多种肿瘤的预后和发生发展具有显著关联。《欧洲泌尿学》上发表的一项研究发现当PCa患者接受快速雄激素去势治疗后,体内早期就会出现PCLAF表达量下降的情况,并且该研究发现PCLAF基因启动子区域具有AR结合位点。然而目前PCLAF在PCa中发挥的作用及其分子机制尚不明确,需要对其进行相关探索和研究。因此本研究将从临床组织、体外细胞系实验、裸鼠模型体内实验三个层次开展进一步的研究,拟为PCLAF在PCa中发挥的作用及其分子机制提供研究基础。研究方法:第一部分:经过筛选,纳入癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中前列腺腺癌（prostate adenocarcinoma,PRAD）队列的484名患者进行研究。从分子特征数据库v7.2中获取雄激素反应、E2F转录激活、脂肪酸代谢、糖酵解、低氧通路、c-MYC转录激活（V1基因集和V2基因集）、氧化磷酸化、PI3K/AKT/mTOR通路的基因集。随后以这九个基因集为背景,对484名患者进行单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）,并将结果作为输入进行一致性聚类,从而将484名患者划分为具有不同特征的亚型。对这些患者的预后进行生存分析从而判断不同亚型的风险水平。随后使用这484名患者的临床数据、增殖评分、已发表亚型、免疫浸润去卷积分析、单核苷酸变异（single nucleotide variants,SNV）数据、拷贝数变异（copy number variants,CNV）数据等验证并定义不同亚型的风险特征。随后使用加权基因共表达网络分析挖掘出和高风险亚型显著相关的基因集以及潜在研究靶点PCLAF,并将这些基因作为输入,通过最小绝对值收敛和选择算子回归模型构建临床预后风险模型。在TCGA-PRAD队列、GSE70769数据集、DKF2018数据集和MSKCC2010数据集中检验模型的有效性。使用岭回归模型,在临床预后风险模型识别的高危患者中预测有效药物。再次利用公用数据库中的数据（TCGA-PRAD队列、DKFZ2018和MSKCC2010）,检测PCLAF与PCa的临床相关性。最后课题组选取了中国医科大学附属盛京医院泌尿外科35名患者的病理废弃组织。其中包括11例前列腺增生组织,24例PCa组织,以及6对PCa配对癌旁组织。使用免疫组化实验（Immunohistochemistry,IHC）和蛋白质免疫印迹实验（Western blot,WB）检测PCLAF在PCa组织中的表达模式。第二部分:在LNCaP、PC-3、DU145三种PCa细胞系以及WPMY-1一种正常前列腺基质细胞系中,通过实时荧光定量聚合酶链式反应实验（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）和 WB 实验检测 PCLAF 的 mRNA 和蛋白表达量。随后使用shRNA慢病毒和过表达慢病毒在LNCaP和PC-3细胞系中分别敲减和过表达PCLAF。在不同分组中,使用CCK-8实验和克隆形成实验检测PCa细胞增殖能力的变化;使用划痕实验检测PCa细胞迁移能力的变化;使用Transwell实验检测PCa细胞侵袭能力的变化;最后构建裸鼠皮下种植瘤模型,检测PCa细胞在体内成瘤能力的变化。第三部分:使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）寻找和PCLAF表达相关的信号通路。随后使用shRNA慢病毒和过表达慢病毒在LNCaP和PC-3细胞系中构建PCLAF稳定敲减和过表达的细胞系。WB实验检测PCLAF表达量改变后,c-MYC蛋白表达量是否发生变化。从而确定PCLAF与c-MYC之间的调控关系。最后,在稳定敲减和过表达PCLAF的细胞系中加入c-MYC通路抑制剂10074-G5处理。再次进行克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验,检测敲减PCLAF对PCa细胞增殖、迁移和侵袭表型的抑制效应能否被10074-G5进一步抑制或者检测过表达PCLAF对PCa细胞增殖、迁移和侵袭表型的促进效应能否被10074-G5有效回复。从而确定c-MYC对PCLAF功能发挥的介导作用。最后使用IHC实验检测裸鼠皮下瘤组织中PCLAF与c-MYC之间的调控关系。结果:第一部分:1、TCGA数据库中的484名PCa患者可以根据雄激素反应、E2F转录激活、脂肪酸代谢、糖酵解、低氧通路、MYC转录激活（V1基因集和V2基因集）、氧化磷酸化和PI3K/AKT/mTOR通路的基因集富集模式被划分为高风险亚型（high risk,RiskH）、中风险亚型（median risk,RiskM）以及低风险亚型（low risk,RiskL）。2、RiskH亚型患者的肿瘤增殖状态更活跃。3、与PCa不良预后相关的SPOP突变与RiskH亚型呈正相关。各亚型患者的SPOP突变频率依次降低:RiskH＞RiskM＞RiskL。此外,课题组之前的亚型研究结果也都支持了 RiskH亚型的不良预后特征。4、RiskH亚型的肿瘤组织纯度更高且浸润的免疫细胞更少。在免疫细胞浸润方面,RiskH亚型的肿瘤组织中活化的自然杀伤细胞和Treg细胞有所减少。5、SPOP的SNV现象以及RHOBTB2和TNFRSF10C的CNV现象在RiskH亚型中更常见。并且RHOBTB2和TNFRSF10C在RiskH亚型中的低表达量现象可能与它们的单拷贝数删失事件有关联。6、本研究发现了一组能够有效代表RiskH亚型的基因,并从中挖掘出了一个潜在的研究靶点PCLAF。7、构建了一个由12个基因组成的临床预后风险模型,并且该模型在多个数据集中表现出稳健的全局表达情况且具有较高的准确性。8、对于预后模型计算出高风险值的患者,莱普霉素B、LY2606368和长春新碱的有效性高。9、PCLAF在转录水平和翻译水平上,均与PCa的发生发展有较显著的临床相关性,其机制研究具有进一步深入的价值。第二部分:1、PCLAF在PCa细胞中具有更高的mRNA和蛋白表达量。2、敲减PCLAF后,CCK-8实验中的吸光度显著下降（单因素方差分析,P＜0.05）以及克隆形成实验的克隆数目显著下降（独立样本t检验,P＜0.05）。3、敲减PCLAF后,划痕实验中的细胞迁移率显著下降（独立样本t检验,P＜0.001）。4、敲减PCLAF后,穿过Transwell小室的细胞数目显著下降（独立样本t检验,P＜0.001）。5、敲减PCLAF后,裸鼠皮下瘤的体积显著下降（单因素方差分析,P＜0.01）,裸鼠皮下肿瘤重量显著下降（Wilcoxon检验,P＜0.05）。6、过表达PCLAF后,CCK-8实验中的吸光度显著上升（单因素方差分析,P＜0.05）以及克隆形成实验的克隆数目显著上升（独立样本t检验,P＜0.01）。7、过表达PCLAF后,划痕实验中的细胞迁移率显著上升（独立样本t检验,P＜0.001）。8、过表达PCLAF后,穿过Transwell小室的细胞数目显著上升（独立样本t检验,P＜0.001）。9、过表达PCLAF后,裸鼠皮下瘤的体积显著上升（单因素方差分析,P＜0.01）,裸鼠皮下肿瘤重量显著升高（Wilcoxon检验,P＜0.01）。第三部分:1、GSEA分析提示E2F通路、c-MYC通路、G2M检查点以及氧化磷酸化与PCLAF表达量具有很高的正相关性,其中c-MYC与PCLAF的关系更具有深入研究的价值。2、敲减PCLAF后,c-MYC的表达量也显著降低（独立样本t检验,P＜0.01）。3、敲减PCLAF可协同10074-G5对c-MYC表达量的抑制效果（独立样本t检验,P＜0.01）。4、过表达PCLAF后,c-MYC的表达量也显著增加（独立样本t检验,P＜0.001）。5、10074-G5可以有效回复PCLAF对c-MYC表达量的促进作用（独立样本t检验,P＜0.01）。6、敲减PCLAF后,克隆形成实验中的克隆数目下降,并且10074-G5可以进一步减少细胞形成的克隆数目（独立样本t检验,P＜0.01）。7、过表达PCLAF后,克隆形成实验中的克隆数目增加,10074-G5可以有效回复增加的细胞克隆数目（独立样本t检验,P＜0.01）。8、敲减PCLAF后,细胞在划痕实验中的迁移率明显下降,10074-G5可以进一步减少细胞的迁移率（独立样本t检验,P＜0.001）。9、过表达PCLAF后,细胞在划痕实验中的迁移率明显增加,10074-G5可以有效回复增加的迁移率（独立样本t检验,P＜0.001）。10、敲减PCLAF后,细胞穿过Transwell小室的数目明显下降,10074-G5可以进一步减少穿过细胞的数目（独立样本t检验,P＜0.001）。11、过表达PCLAF后,细胞穿过Transwell小室的数目明显增加,10074-G5可以有效回复增加的穿过细胞数目（独立样本t检验,P＜0.001）。12、IHC实验提示,裸鼠皮下瘤组织（敲减PCLAF组）中PCLAF表达量减少后,c-MYC的表达也减少。13、IHC实验提示,裸鼠皮下瘤组织（过表达PCLAF组）中PCLAF表达量增加后,c-MYC的表达也会随之增加。结论:1、研究创新性地根据雄激素反应、E2F转录激活、脂肪酸代谢、糖酵解、低氧通路、c-MYC转录激活（V1基因集和V2基因集）、氧化磷酸化和PI3K/AKT/mTOR通路这些关键生物学过程将PCa划分为3个风险水平不同的亚型。2、三种风险亚型在临床相关性、增殖评分、既往发表亚型关系、免疫浸润、SNV和CNV等方面具有显著差异。3、本研究又基于高危亚型相关基因构建并验证了一个有效的临床预后风险模型,从而量化预后。具有高风险值的患者的有效药物也得到了预测。4、研究从RiskH亚型相关基因中挖掘出了一个潜在的研究靶点PCLAF,并通过实验验证PCLAF在转录水平和翻译水平上,均与PCa的发生发展有较显著的临床相关性。5、敲减PCLAF后,PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和体内成瘤能力下降。6、过表达PCLAF后,PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和体内成瘤能力升高。7、PCLAF对c-MYC的表达具有正向调控作用。8、PCLAF可通过c-MYC的介导发挥其对PCa发生发展的促进作用。