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恶性肿瘤发生依赖于细胞能量代谢的重新编程,这既是其他致癌因素相互作用的直接后果,也可能是导致其他肿瘤特征产生的主要原因。肿瘤细胞新陈代谢的一个共同特征是能够从经常缺乏营养的环境中获取必要的营养,并充分利用这些营养物质来维持生存或促进增殖。伴随着肿瘤相关的代谢重编程,细胞内外的代谢物也会产生相应的改变,从而对基因表达、细胞增殖分化及肿瘤微环境产生深远影响。目前关于癌症相关的代谢的研究显主要集中在以下几个方面:（1）代谢底物的摄取环节调控异常（主要为葡萄糖和氨基酸）;（2）营养物质的利用和转化方式的改变;（3）使用糖酵解或三羧酸循环中间产物进行快速的生物合成;（4）对氮的需求增加;（5）不同代谢通路相关基因的调控改变;（6）代谢与肿瘤微环境的相互作用。虽然很少有肿瘤具有全部的六种特征,但大多数的肿瘤包含上述的多种代谢特点。这些代谢的特征性变化在很大程度上对细胞的能量工厂——线粒体产生了复杂的影响,包括线粒体的数目,线粒体DNA的突变,线粒体膜的电位变化,线粒体内部参与代谢的各种酶类物质的表达和活性异常等。单个肿瘤所表现出的一些特异性的代谢特征可能有助于更好的肿瘤分类和指导治疗。肿瘤的发生是一个慢性的长期演变的过程,遗传因素和环境因素相互作用,相互影响促进肿瘤的发生和发展。本课题主要关注在细胞已经发生SHP-2 D61G激活突变的基础上,是否会对环境污染物砷的慢性暴露更加敏感,从而使细胞发生更严重的恶性转化。在此过程中,细胞内的能量代谢状态会产生何种改变并探讨其中的调控机制,寻找可能的靶点加以干预从而减轻或延缓细胞的恶性转化。目的:研究SHP-2D61G激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞在重金属污染物三氧化二砷的慢性诱导下发生恶性转化的过程中是否存在细胞能量代谢水平的改变及其可能的调节机制。方法:用低剂量的三氧化二砷长时间慢性诱导SHP-2野生型（wild type,WT）和D61G激活突变型（D61G mutant,D61G）的小鼠胚胎成纤维细胞,对比两组细胞在砷慢性处理条件下细胞恶性转化的程度是否有差异。采用细胞计数,平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力,通过transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力,软琼脂集落形成实验和裸鼠成瘤实验检测细胞的非锚定生长能力和裸鼠成瘤能力。利用Seahorse XFe24细胞能量代谢分析仪结合线粒体压力测试试剂盒和糖酵解压力测试试剂盒检测细胞的有氧磷酸化水平和无氧糖酵解水平,反映细胞的能量代谢的表型的变化,比较细胞在基础水平和极限状态下的代谢能力是否有差异。同时,利用ATP检测试剂盒测定细胞中ATP的生成量是否与细胞的恶性程度相适应。在有氧代谢方面,采用流式细胞术检测细胞的活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生情况以反映线粒体的氧化应激水平,并结合线粒体呼吸链复合物的检测验证线粒体的有氧代谢能力。无氧代谢方面,利用流式细胞术检测细胞对2-NBDG（一种荧光素标记的葡糖糖模拟物）的摄取能力反映细胞能量代谢的底物是否存在差异。同时检测细胞产生的乳酸水平验证细胞的无氧酵解能力是否增强。提取细胞总蛋白通过免疫沉淀实验检测代谢相关通路如AMPK,m TOR等分子的表达水平,确定参与调控代谢改变的主要信号通路。同时针对该通路,抑制关键蛋白分子的表达,检测细胞增殖效应及能量代谢的差异,从而反向验证。结果:1、筛选确定三氧化二砷慢性诱导浓度,并建立稳定诱导小鼠胚胎成纤维细胞株在0.1μM和10μM之间选择设定浓度梯度,三氧化二砷急性诱导细胞48小时后,细胞计数结果确定2.5μM为慢性诱导的砷浓度,以此浓度处理细胞约50代（三天传代一次）,建立稳定细胞株,同时以PBS缓冲液处理组作为对照。2、低浓度三氧化二砷慢性处理能明显增强SHP-2D61G小鼠胚胎成纤维细胞的增殖能力。细胞计数实验结果显示野生型和突变型小鼠胚胎成纤维细胞经低浓度三氧化二砷慢性处理5个月后,SHP-2D61G组小鼠胚胎成纤维细胞的生长能力明显增强,MTT和细胞平板克隆实验也提示了相同的结果。3、低浓度三氧化二砷慢性处理能增强SHP-2D61G突变组的小鼠胚胎成纤维细胞的迁移能力,但突变组细胞的侵袭能力有所下降。细胞迁移实验结果显示SHP-2D61G突变组的细胞迁移数量明显高于野生型细胞组,经三氧化二砷慢性处理后,两种细胞的迁移能力均有增强,但突变组细胞更为明显。Transwell侵袭实验结果表明,砷处理后野生型组和突变组的细胞侵袭能力均较之于未处理组均有所下降,而突变组侵袭能力降低更为明显。4、裸鼠成瘤实验结果显示SHP-2D61G突变组具有更强的成瘤能力,且经砷慢性处理后,突变组的成瘤能力更加明显。将经砷慢性处理建立的野生型和突变型小鼠胚胎成纤维细胞株以及PBS处理的对照组细胞分别接种裸鼠皮下,每天记录瘤体生长情况,等小鼠皮下瘤体体积接近200 mm~3时处死小鼠,比较不同组间瘤体体积和重量的差异,结果表明PBS对照组和砷处理组的野生型SHP-2细胞均不能成瘤,而SHP-2D61G突变组的细胞能够在裸鼠皮下成瘤,且经砷诱导后其成瘤能力明显增强,瘤体的体积及重量均较PBS对照组有所增加。5、Seahorse细胞能量代谢分析仪检测显示经砷处理后,野生型和突变型小鼠胚胎成纤维细胞的有氧和无氧代谢能力均有增强,突变组细胞均有更大的代谢潜力。利用Seahorse线粒体压力检测试剂盒和糖酵解压力检测试剂盒结合细胞能量代谢分析仪检测对照组和砷诱导组的野生型和SHP-2D61G突变型小鼠胚胎成纤维细胞的能量的代谢水平变化。结果显示:PBS对照组中,突变型小鼠胚胎成纤维细胞的氧气消耗速率（oxygen consumption rate,OCR）和细胞外酸化速率（extracellular acidification rate,ECAR）值均有所增加,经砷诱导后,其基础代谢水平及最大代谢潜力均表现出增加的趋势。且细胞水平的ATP检测结果显示细胞经砷慢性处理后,ATP的含量增高明显。流式细胞术检测结果表明ROS的产生在SHP-2D61G组产生增加,且经砷诱导后,突变组的活性氧的产生显著增加。乳酸生成检测及葡萄糖摄取实验显示SHP-2野生型和突变组,在PBS对照组和砷处理组中无明显变化。6、细胞能量代谢通路信号分子检测结果表明,m TOR信号通路在砷诱导后的SHP-2D61G突变组活性明显增强。免疫沉淀实验检测结果表明,PBS处理对照组中,SHP-2D61G突变组的m TOR信号通路有所增强,上游p-AMPK分子表达减少,而下游的分子p-m TOR,p-p70sk分子均表达增加。用m TOR的抑制剂雷帕霉素处理细胞可以明显抑制m TOR的磷酸化水平及下游的信号通路活化,且抑制细胞的增殖,Seahorse能量代谢检测提示细胞的能量代谢水平收到抑制。结论:1、SHP-2D61G激活突变协同低浓度三氧化二砷慢性处理能促进小鼠胚胎成纤维细胞发生恶性转化,且突变组细胞增殖能力显著增强。2、慢性砷诱导小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化中所表现的细胞快速增殖与其明显升高的线粒体有氧磷酸化水平和细胞无氧酵解水平增强有关,且SHP-2D61G突变组更为显著。3、砷处理突变组的小鼠胚胎成纤维细胞中ATP生成增加,线粒体氧化应激产物ROS水平进一步证明细胞在砷慢性处理后线粒体能量代谢水平增高。4、mTOR信号通路活化可能参与调节砷诱导后的细胞线粒体有氧代谢水平升高。