论文部分内容阅读
家蚕是鳞翅目昆虫模式生物,其雌雄个体经济价值差异明显,因此对家蚕性别决定的研究不仅可为鳞翅目害虫防治提供参考,而且在养蚕业方面具有产业应用价值。先前研究发现位于家蚕性别决定信号通路下游的Bmdsx基因是家蚕性别分化开关基因,Bmdsx的不同选择性剪接形式决定了家蚕个体性别分化的方向。BmPSI（Byxbom mori P-element somatic inhibitor）蛋白可以特异地结合上Bmdsx pre-mRNA的第4外显子CE1元件,促进Bmdsx的雄性特异性剪接。当敲除BmPSI基因后,转基因家蚕个体中许多性别调控关键基因出现表达紊乱,下游最关键的Bmdsx的剪切形式出现变化,雄性个体中出现Bmdsx雌性剪接形式。另外,先前研究者曾构建家蚕酵母双杂交早期胚胎cDNA文库,并以BmPSI为诱饵筛选文库,发现了与BmPSI结合的剪接体蛋白——BmSPX,我们推测BmSPX可能参与家蚕Bmdsx的选择性剪切过程。为研究PSI调控dsx在昆虫物种间的保守性以及BmPSI互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx选择性剪切的调控作用,我们设计实验方案,获得以下研究结果:1.BmPSI结构域与Bmdsx pre-mRNA的结合活性研究BmPSI蛋白包含4个KH1结构域,该类结构域为RNA结合结构域,本研究构建分别删除其中1个KH1结构域的截短蛋白表达载体,纯化这4种截短蛋白,将4种截短蛋白和全长BmPSI蛋白分别与CE1 RNA探针进行EMSA结合实验。结果显示,4个截短蛋白对CE1结合能力都减弱,其中删除了第一个和第二个KH1结构域的2个截短蛋白与CE1结合能力最弱,这表明家蚕BmPSI蛋白结合CE1的能力由4个KH1结构域共同提供,其中前面两个KH1结构域起主要作用。2.BmPSI蛋白结合CE1关键氨基酸位点的发现及验证将4个KH1结构域氨基酸序列进行多序列比对,根据前两个KH1中保守氨基酸位点筛选影响BmPSI结合CE1探针的潜在关键氨基酸位点。同时基于先前文献报道,KH1活性主要受内部保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile（IGGI）影响,本研究对BmPSI结合RNA能力的7个潜在关键氨基酸位点分别进行突变,过量表达并纯化这7种突变的全长BmPSI蛋白。将突变蛋白和CE1序列的RNA探针分别进行EMSA实验,结果发现其中I116G、L127G和mut IGGI这三种突变蛋白的结合能力明显减弱,利用EMSA冷竞争实验证实结合特异。利用圆二色光谱技术检测突变蛋白二级结构,结果显示三种突变蛋白与野生型BmPSI蛋白相比无明显结构差异,同时采用ITC（等温滴定量热法）对突变蛋白与CE1探针的结合亲和常数进行测定,结果发现这三种突变的引入都使BmPSI蛋白结合CE1探针的能力显著减弱。3.PSI结合dsx pre-mRNA在斜纹夜蛾中的保守性研究为研究PSI蛋白与CE1调控元件结合在鳞翅目昆虫中的保守性,本研究开展了家蚕以外的鳞翅目昆虫的PSI蛋白研究。基于斜纹夜蛾基因组计划已经完成,本研究分析了斜纹夜蛾基因组中双性基因（Sldsx）的序列信息,结果显示Sldsx的CE1元件序列与家蚕中序列完全相同。然后,对斜纹夜蛾SlPSI基因进行克隆,构建表达载体并纯化该蛋白。将SlPSI蛋白与CE1探针进行EMSA结合实验,结果显示SlPSI蛋白与CE1探针结合。根据家蚕BmPSI突变位点信息,对SlPSI相同氨基酸位点进行突变,后利用EMSA实验比较突变蛋白与CE1探针的结合能力,结果发现其中I116和IGGI两种位点对SlPSI蛋白结合RNA的能力具有重要的影响,而L127位点的突变对SlPSI结合CE1能力无明显影响。本研究结果表明PSI蛋白与dsx pre-mRNA中CE1元件的结合在鳞翅目昆虫中具有一定的保守性。4.家蚕BmPSI结合蛋白BmSPX的功能研究先前研究表明家蚕性别决定关键蛋白BmPSI可与剪切体蛋白BmSPX结合,为进行BmSPX的功能研究,本实验首先利用piggyBac转基因增量表达载体构建piggyBac-BmSPX重组载体,通过胚胎显微注射获得家蚕BmSPX增量表达品系Over-BmSPX,通过多代连续饲养及荧光筛选获得稳定携带红色荧光的转基因品系。提取转基因个体基因组,对转基因插入情况进行检测,发现BmSPX插入位点在第11号染色体基因间区。通过转基因个体cDNA实时荧光定量PCR检测,发现在转基因雄性个体中,BmSPX表达量上调了约30倍;而在雌性转基因个体中,BmSPX表达量上调了约4倍。综上结果可知,我们获得了稳定遗传的转基因BmSPX增量表达品系。对发育至蛾期的转基因增量表达BmSPX家蚕进行表型观察,同时观察到内生殖器和外生殖器的发育紊乱现象。因此我们推断BmSPX基因在雌、雄家蚕性别分化过程中均发挥重要作用。为研究BmSPX在家蚕性别决定中的生理功能,我们对Over-BmSPX转基因品系进行分子水平检测,检测到伴随BmSPX基因表达的明显上调,BmMasc、BmIMP和Bmdsx-F等基因表达量发生明显变化。同时,将BmSPX基因克隆到pSL1180过表达载体中,利用家蚕BmE细胞对家蚕BmSPX和BmPSI两种蛋白进行CO-IP（免疫共沉淀）实验,证实两者在家蚕细胞环境下存在相互作用。利用家蚕胚胎细胞系BmE细胞进行亚细胞定位,发现BmSPX蛋白属于核质穿梭蛋白。由于BmSPX具有精巢组织特异表达的性质,这与家蚕性别决定关键基因BmMasc精巢特异高量表达的情况一致,因此,我们利用CO-IP实验证明:BmSPX蛋白确实与BmMasc蛋白存在相互作用关系。结合转基因品系Over-BmSPX检测及以上其他实验结果,我们推断BmSPX蛋白作为Bmdsx雄特异性剪切阻遏复合体中的蛋白组分参与Bmdsx的选择性剪切。同时,BmSPX蛋白表达量的积累能够造成家蚕性别决定级联网络的调控变化,引起上游BmMasc、BmIMP的表达上调进而促进Bmdsx的雄特异性剪切,进而促进家蚕个体的雄性化发育。综上所述,本论文对家蚕性别决定关键蛋白BmPSI参与Bmdsx选择性剪接的关键氨基酸位点进行鉴定,首次发现除保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile外对KH1结构域结合RNA能力具有显著调控作用的关键氨基酸位点I116,并发现PSI蛋白对双性基因dsx pre-mRNA关键元件CE1的结合在鳞翅目昆虫中具有一定保守性;通过多种分子手段证明可与BmPSI结合的家蚕剪接体蛋白BmSPX在家蚕性别决定中具有重要作用,使得家蚕性别决定级联调控进一步完善。