【摘 要】
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干旱和土壤盐渍化是影响作物产量的两个主要因素。目前,全世界可耕作土地盐渍化程度不断增长。通过基因工程手段提高农作物的耐盐碱性以改良盐渍化土壤成为科研工作者研究的
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干旱和土壤盐渍化是影响作物产量的两个主要因素。目前,全世界可耕作土地盐渍化程度不断增长。通过基因工程手段提高农作物的耐盐碱性以改良盐渍化土壤成为科研工作者研究的热点,而获得功能确定的耐盐基因则是其前提条件。本研究在前期构建的藜盐胁迫抑制差减文库的基础上,从新的和未知功能的ESTs半定量检测中筛选出9个随盐胁迫上调表达的ESTs序列,通过RACE(cDNA末端快速扩增)的方法获取ESTs所在序列的全长,用生物信息学软件对获得的序列进行分析和功能预测;设计特异性引物对初筛的ESTs进行cDNA全长扩增;并利用来自EST05和EST646的全长序列的预测基因(分别命名为P5P和TI),构建植物表达与干扰载体,转化模式植物拟南芥,并在转基因后代中检测这两个基因对植物耐盐能力的贡献。结果如下:(1)通过RACE实验对9个目标ESTs进行了扩增,得到了6个ESTs的5′和3′端序列,包括EST05,EST14,EST179,EST340,EST544和EST646;EST04和EST140得到了3′端序列;EST702获得了5′端序列。利用生物信息学方法,在GenBank中对获得的拼接序列进行了Blastx和Blastn同源比对,结果发现:EST04为已知功能基因-捕光叶绿素a/b结合蛋白基因;EST05与Ricinus communis预测的磷酸肌醇5-磷酸酶基因有较高匹配度;EST544与EST646为同一基因,都与Populus trichocarpa胰蛋白酶抑制剂基因有较高相似性;EST140与EST340与预测的未知功能蛋白基因具有相似性;EST14,EST179与EST702均没有发现相似的靶标基因。(2)以藜的cDNA为模板,经PCR扩增获得了EST05和EST646的cDNA全长序列。EST05全长(预测的ORF)为2042bp,可编码607个氨基酸;EST646的全长(预测的ORF)出现异构现象,其中较长序列为659bp,可编码212个氨基酸,较短序列为631bp,可编码203个氨基酸。(3)构建了P5P(来自EST05预测基因简称)和TI(来自EST646预测基因简称)基因的植物表达与干扰载体,并通过花絮浸染法转化了拟南芥,已获得转基因拟南芥T1代植株。本研究通过RACE技术成功扩增获得了两个与耐盐相关的基因全长,并构建了植物表达与干扰载体,对模式植物拟南芥进行了转化并获得了转基因后代,这为后期基因功能的鉴定打下良好基础。
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