目的目前认为90%的卵巢癌起源于卵巢表面上皮细胞(Ovarian Surface Epithelial Cell,OSEC)。很多研究表明,维生素D可以抑制多种肿瘤的发生、发展并且改善其预后。本实验室前期已经成功建立小鼠卵巢表面上皮细胞自发恶性转化模型——MOSEC(Mouse Ovarian Surface Epithelial Cell),并且证明上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)参与了此过程。为了研究维生素D是否抑制MOSEC的自发恶性转化,本研究通过维生素D对MOSEC的连续性处理,检测MOSEC基本性质的改变、EMT相关蛋白的表达、调控EMT基因的表达以及维生素D代谢关键酶等的变化,探讨活性维生素D对MOSEC自发恶性转化过程的作用及其可能机制。方法1.确定活性维生素D是否对卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程有抑制作用在MOSEC体外培养过程中,从P20(第20代细胞,下文以此类推)开始连续加入1nmol/L活性维生素D直到P120,在此过程中每隔10代,分别使用平板克隆、软琼脂克隆、Transwell和划痕实验等检测活性维生素D对MOSEC恶性转化各个阶段细胞的体外增殖能力以及迁移能力的影响。用CCK-8检查活性维生素D是否影响了MOSEC对紫杉醇的敏感性。裸鼠腹腔注射105个P90细胞,比较对照组和活性维生素D处理组细胞在裸鼠体内的成瘤及转移情况,从体内和体外实验来说明活性维生素D是否延缓了卵巢表面上皮细胞的恶性转化。2.活性维生素D是否通过调节EMT来延缓MOSEC恶性转化过程实验观察对照组和活性维生素D处理组细胞形态的改变,使用Western-blotting和免疫荧光检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin和Snail等的表达变化,并且使用Real-time Q-PCR检测EMT相关基因SPP1、MMP3、COL3A1及其ESR1等的表达变化,分析活性维生素D是否通过调节EMT延缓了卵巢表面上皮细胞自发恶性转化的过程。3.维生素D代谢关键酶对MOSEC恶性转化过程的影响实验使用Real-time Q-PCR与免疫荧光检测维生素D代谢关键基因CYP27B1和CYP24A1以及VDR表达在MOSEC恶性转化过程的变化,并且分析活性维生素D对这一过程的影响。使用SAS软件分析传代次数和活性维生素D刺激两种因素的联合作用,探讨活性维生素D在卵巢表面上皮细胞不同转化阶段的实际有效作用量,进一步阐明活性维生素D延缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的可能机制。结果1活性维生素D延缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程(1)体外增殖能力:根据活性维生素D对MOSEC的细胞形态、增殖能力、迁移能力的作用,将MOSEC的恶性转化阶段分为三期,即Ⅰ期(P20-P60)、Ⅱ期(P70-P90)、Ⅲ期(P100-P120)。平板克隆实验结果显示,随着MOSEC恶性转化过程,活性维生素D虽然增大了Ⅱ和Ⅲ期细胞的克隆直径(P<0.0005),但是抑制了三个阶段细胞的克隆形成率(P<0.05)。软琼脂克隆实验结果表明,活性维生素D抑制Ⅰ期和Ⅲ期细胞的克隆形成率(P<0.05),但是却促进了Ⅱ期细胞的软琼脂克隆形成率(P<0.05)。(2)体内致瘤性:由于活性维生素D促进了Ⅱ期MOSEC的体外增增殖能力,因此,本研究使用体内致瘤实验比较分析P90对照组与处理组细胞在裸鼠体内成瘤能力的变化。与对照组细胞相比较,活性维生素D减弱了处理组细胞的成瘤能力,具体表现为:肿瘤转移灶减少(5.1561g vs 1.2335g),肿瘤组织新生血管的生成和不规则的多核细胞减少,腹水形成量减少(13ml vs 4ml),腹水细胞中的肿瘤细胞减少,并且抑制了腹水细胞中N-cadherin、MMP3与CYP24A1的表达(P<0.001),以上实验结果说明活性维生素D长期处理的卵巢表面上皮细胞在裸鼠体内的致瘤能力减弱。(3)MOSECP90对化疗药物的敏感性:随着紫杉醇浓度的增加,对照组和维生素D处理组MOSEC的存活率都呈现下降趋势,并且在50 n M的浓度时,细胞存活率最小。同时发现在同一个浓度下,1,25(OH)2D3处理组MOSEC的细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)。实验结果说明性活性维生素D增强了卵巢表面上皮细胞对紫杉醇的敏感性。(4)体外迁移能力:在MOSEC自发恶性转化过程中,虽然活性维生素D对P60、P70细胞的迁移能力没有影响(P>0.05),但是抑制了其余各代数细胞的迁移,并且减弱了P40细胞在12、24、48h三个时间点的划痕愈合能力(P<0.05),说明活性维生素D抑制了卵巢表面上皮细胞的体外迁移能力。2活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程与调控EMT有关(1)细胞形态的改变:体外长期连续培养过程中,对照组MOSEC由上皮细胞的“鹅卵石形”转化成间质细胞样的“纺锤梭形”。活性维生素D在Ⅰ、Ⅲ期抑制这种转化进程,而在Ⅱ期却促进了此进程。(2)EMT标志蛋白的表达:Western-blotting的实验结果显示,随着MOSEC体外恶性转化过程,活性维生素D抑制了EMT相关蛋白N-cadherin、Snail和β-catenin的表达,促进了E-cadherin的表达。免疫荧光与此一致,同时还显示活性维生素D抑制了β-catenin向核内转移。说明活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程与调控EMT标志蛋白有关。(3)EMT相关基因的表达:在MOSEC的Ⅰ期,活性维生素D促进了MMP3、ESR1的表达,抑制了SPP1的表达,对COL3A1的没影响,说明活性维生素D通过下调SPP1、上调ESR1来抑制I期细胞的EMT进程。在Ⅱ期,活性维生素D促进了SPP1、COL3A1的表达,抑制了MMP3与ESR1的表达。说明活性维生素D在此期通过下调MMP3抑制EMT,通过上调SPP1、COL3A1与下调ESR1的表达促进细胞的增殖能力。在Ⅲ期,活性维生素D通过下调SPP1和MMP3、上调ESR1抑制III期细胞的EMT。以上实验结果说明在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段,活性维生素D调控的EMT相关基因也不同,这可能是它对不同阶段细胞增殖能力影响不同的原因之一。3活性维生素D延缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化与维生素D代谢关键酶的变化有关Real-time Q-PCR的实验结果显示,在MOSEC的自发恶性转化过程中,对照组中活性维生素D合成基因CYP27B1、降解基因CYP24A1与维生素D受体(Vitamin D Receptor,VDR)的表达都呈现一个正态分布曲线的趋势,并且在II期细胞P70时达到最大值。活性维生素D处理刺激了每一个代数细胞中CYP24A1的表达剧增(p<0.05),最高者达到了15000倍,但是其增长的幅度不同,在处理组P60和P90的表达量明显高于其他代数,也就是说CYP24A在Ⅱ期细胞的表达比Ⅰ和Ⅲ期高。同时实验发现处理组Ⅱ期细胞CYP27B1与VDR的表达下降,结合此期相对较高表达的CYP24A1的结果,说明II期活性维生素D的有效作用量减少。与同一代数对照组的MOSEC比较,Ⅰ期处理组细胞CYP27B1与VDR的表达升高,与此期相对较低表达的CYP24A1的结果结合分析,说明I期活性维生素D的有效作用量增加。同理,Ⅲ期细胞CYP27A1与VDR的表达没有变化,而CYP24A1的表达相对较低结合发现,说明III期活性维生素D的有效作用量增加。以上实验结果说明,在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段,虽然加入同样浓度的活性维生素D干预,但是由于维生素D代谢酶和VDR表达的变化,导致每一阶段活性维生素D的有效作用量不同,对细胞增殖能力的影响也不同。结论1活性维生素D可以延缓小鼠卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程,这与它抑制I期和III期细胞的体外增殖能力和迁移能力、增加了Ⅱ期细胞对紫杉醇的敏感性、并且减弱II期细胞的体内致瘤性和转移能力有关。但是本实验也发现活性维生素D促进了Ⅱ期细胞的增殖能力。2在小鼠卵巢表面上皮细胞恶性转化的过程中,活性维生素D通过上调上皮细胞标志物E-cadherin、下调间质细胞标志物N-cadherin和EMT转录因子Snail和β-cantenin等蛋白表达抑制了EMT进程。但是,在恶性转化的不同时期,活性维生素D调控的EMT相关基因也不同。3在小鼠卵巢表面上皮细胞自发恶性转化过程中,活性维生素D合成基因CYP27B1、降解基因CYP24A1和VDR的变化导致每一阶段活性维生素D的有效作用量不同。在I期和III期,CYP27B1和VDR的高表达以及CYP24A1的低表达使活性维生素D的有效作用量相对增加,而在II期,因为CYP24A1表达剧增和VDR表达减少,使得活性维生素D在此阶段的有效作用量减少。