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腺样囊性癌(ACC,adenoid cystic carcinoma)是涎腺最常见的恶性肿瘤之一,其治疗以综合治疗为主,对于不能手术的肿瘤或者不能切除的复发病例,化疗是主要的治疗手段。因此由于长期使用一种药物而产生的对其他多种药物耐药的特性,即多药耐药(MDR,Multidrug resistance)的产生而导致的治疗失败在临床上很常见。目前研究最广泛的耐药机制就是细胞将药物泵出的膜转运蛋白。这些转运蛋白包括P-糖蛋白(P-gp,p-glycoprotein)、多药耐药相关蛋白(MRP,Multidrug resistance-associated protein)等。MRP与P-gp多药耐药谱相似,但也不尽相同,两者通过转运化疗药物产生MDR的机制也有差别。目前认为MRP也是一种ATP依赖泵,能将带负电荷的药物分子逆浓度泵出到细胞外,减少细胞内药物浓度,导致肿瘤耐药的发生。逆转多药耐药最引人注目的是RNA干涉(RNAi,RNA interference)技术。用RNAi技术沉默多药耐药基因(MDR gene,Multidrug resistance gene),抑制P-gp表达,逆转肿瘤细胞耐药性已有不少文献报道,但是以RNAi技术沉默多药耐药相关基因(MRP gene,Multidrug resistance-associated gene),抑制MRP蛋白表达却少见报道。博莱霉素(BLM,Bleomycin)是治疗头面部肿瘤的常用药物,本研究通过采用大剂量BLM反复作用于腺样囊性癌细胞(ACC-2),建立了耐药细胞系ACC-2/BLM,为探讨涎腺癌耐药机制以及逆转耐药提供体外研究模型。继而针对在ACC-2/BLM耐药细胞中高表达的MRP1基因,设计合成shRNA片段,通过瞬时转染ACC-2/BLM细胞,验证了shRNA设计与合成的合理性,可以得出RNAi技术同样可以干涉MRP1基因表达的结论,为进一步检测肿瘤耐药性逆转效果提供研究基础。研究内容1、采用大剂量BLM(20?/ml)24小时暴露法反复处理腺样囊性癌细胞系ACC-2细胞,获得耐药细胞系ACC-2/BLM;通过MTT法、细胞计数法、流式细胞术等方法,观察ACC-2/BLM细胞的生物学特性的变化。2、应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR,reverse transcription polymerase chain reaction)检测MDR1和MRP1 mRNA表达以及应用免疫荧光细胞化学染色间接法检测相应的P-gp和MRP蛋白在ACC-2和ACC-2/BLM细胞中的表达。3、按照siRNA设计原则,设计4条针对MRP1基因的shRNA ,构建pGPU6/GFP/Neo-MRP1真核表达载体,转染ACC-2/BLM细胞,通过RT-PCR分别检测转染24h、48h和72h后MRP1基因沉默情况。4、应用基因芯片筛选ACC-2与ACC-2/BLM细胞表达差异基因,并初步分析。实验结果1、建立了博莱霉素诱导的人口腔涎腺腺样囊性癌耐药细胞系ACC-2/BLM,耐药指数为7.299,与5-氟尿嘧啶(5-FU,5-Fluorouracil)、顺铂(CDDP,Cisplatin)、环磷酰胺(CTX,Cyclophosphamide)、长春新碱(VCR,Vincristine)等抗癌药有明显的交叉耐药,耐药指数分别为1.03、2.15、1.114、5.96;与ACC-2细胞相比,ACC-2/BLM细胞倍增时间延长,S期细胞减少,G1、G2期细胞增多,克隆形成率增加,细胞溶酶体增多。2、RT-PCR检测结果显示ACC-2以及ACC-2/BLM细胞均不表达MDR1基因,而MRP1基因在ACC-2/BLM细胞中的表达明显强于ACC-2细胞。免疫荧光细胞化学染色结果显示,在ACC-2 /BLM细胞中MRP蛋白表达也强于ACC-2细胞。3、转染24h后用荧光显微镜观察转染不同片段shRNA的ACC-2/BLM细胞,转染效率相近,约为40-50%。RT-PCR结果显示,转染第四个shRNA片段的ACC-2/BLM细胞,MRP1 mRNA在72h时表达水平明显下降。4、以ACC-2细胞以及ACC-2/BLM细胞为模型,应用基因表达谱芯片筛选多药耐药相关基因,41000个基因中筛选出上调基因有514个,下调基因有469个。结论1、大剂量24小时暴露法可使BLM致ACC-2细胞产生耐药性,ACC-2/BLM细胞系具有多药耐药特性,属于中等耐药。2、MRP1基因及其编码的MRP蛋白在ACC-2/BLM细胞中的高表达,可能与ACC-2/BLM细胞系产生多药耐药性有关。3、成功构建了能表达MRP1 shRNA的质粒载体pGPU6/GFP/Neo-MRP1,并且可以有效的降低MRP1 mRNA表达水平,说明MRP1 shRNA干涉序列设计合理,所合成的shRNA能够特异性阻断MRP1基因在ACC-2/BLM细胞中的表达。4、ACC-2/BLM细胞产生多药耐药性与众多基因相关,其机制和原因有待进一步研究。