论文部分内容阅读
面对复杂多变的环境,植物进化出了高效精确的信号传导系统和应答措施。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联信号系统是高度保守的信号传导系统,在调控植物的生长、发育及胁迫反应等各个方面都起着非常重要的作用。经典的MAPK级联系统由MAPKKK、MAPKK和MAPK三级激酶组分组成,通过逐级磷酸化方式传递并放大信号。相对于拟南芥、水稻等植物而言,玉米中关于MAPK级联系统的研究较少,本研究利用玉米原生质体系统和模式植物拟南芥对发现的D组ZmMKK10参与调控细胞死亡过程进行了初步探索。利用拟南芥基因组上10个MKK基因的保守序列比对玉米B73基因组,找到一个具有MAPKK保守激酶结构域的基因,命名为ZmMKK10。Q-PCR分析玉米不同组织中ZmMTK10的转录水平显示ZmMKK10在各组织中均有表达。玉米叶肉细胞原生质体中瞬时表达ZmMKK10蛋白的结果显示其主要定位于细胞质。体外自磷酸化实验结果表明ZmMKK10的激酶活性依赖于Mg2+。研究MKK功能的常用手段是利用定点突变技术模拟持续激活形式和持续失活形式的MKK,因此对ZmMKK10进行点突变分别获得ZmMKK10DD (持续激活型)和ZmMKK10KR (持续失活型)对ZmMKK10进行功能探索。鉴于过表达ZmMKK10WT (野生型ZmMKK10)和ZnMKK10DD的玉米转基因阳性植株无法获得,本研究利用玉米叶肉细胞原生质体系统瞬时表达ZmMKK10WT或ZmMKK10DD能够显著增加原生质体的细胞死亡率,ZmMKK10KR则没有显著变化,这些结果表明ZmMKK10在玉米体内正调控细胞死亡过程。无法获得转基因玉米植株,因此利用模式植物拟南芥进一步探究ZmMKK10调控细胞死亡过程的机制。构建并获得稳定遗传诱导表达型转基因拟南芥植株ZmMKK10WT、ZmMKK10DD和ZmMKK10KR,DEX诱导后ZmMKK10WT和ZmMKK10DD植株出现叶片萎蔫、离子泄露等死亡现象,而ZttmMKK10KR和Vector转基因植株则生长正常,没有出现细胞死亡现象。进一步的杂交材料ZmMKK10DD/mpk6和ZmMKK10DD/mpk3证明ZmMKK10通过激活MPK6/MPK3诱导细胞死亡过程。另外,ZmMKK10激活MPK6/MPK3引起乙烯合成和H202积累。乙烯合成抑制剂和H202清除剂可以抑制ZmMKK10诱导的细胞死亡现象。综合上述结果,ZmMKK10激活MPK6/MPK3诱导的细胞死亡是由乙烯合成和H2I2积累介导。为了寻找ZmMKK10的下游底物MPKs,利用酵母双杂交系统筛选20个ZmMPKs中与ZmMKK10互作的蛋白,体外磷酸化实验进一步确证ZmMPK3和ZmMKPK7 (拟南芥MPK3和MPK6的同源蛋白)在体外能够被ZmMKK10直接磷酸化。综合上述结果,ZmMKK10在玉米体内正调控细胞死亡过程的下游MPK可能是ZmMPK3和ZmMPK7。本研究发现D组ZmMKK10在玉米体内正调控细胞死亡过程,而且该过程可能是通过激活下游ZmMPK3/ZmMPK7实现,这一发现补充了玉米中关于MAPK级联系统的研究,为深入研究ZmMKK10的功能提供了研究基础。