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目的:Pam3CSK4是人工合成TLR2(Toll-like receptor 2)配基,可以通过TLR2影响中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)功能,本课题应用Pam3CSK4预处理GM-CSF诱导的小鼠骨髓中性粒细胞,探讨预处理后的中性粒细胞对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)杀菌抑菌功能的影响,并初步探讨其相关机制,为MRSA的免疫学防治提供新思路。方法:1、Pam3CSK4预处理GM-CSF诱导的中性粒细胞24h、48h后,流式检测预处理后中性粒细胞对FITC标记的热灭活耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(heatkilled methicillin resistant staphylococcus aureus,HK-MRSA)、热灭活大肠埃希菌(heat-killed Escherichia coli,HK-E.coli)的吞噬作用;用平板计数法检测Pam3CSK4预处理24h、48h的中性粒细胞对MRSA、E.coli的杀菌或抑菌功能。2、Transwell检测Pam3CSK4预处理24h、48h后对GM-CSF诱导的中性粒细胞趋化能力的影响。3、Pam3CSK4预处理GM-CSF诱导的中性粒细胞6h、12h后,再给予HK-MRSA刺激,q-PCR方法检测炎症相关基因(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10)、氧化应激基因(COX2、iNOS)和抗菌肽LL37的表达情况。ELISA法检测IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α等细胞因子的分泌。4、ELISA和流式法分别检测不同浓度Pam3CSK4预处理对中性粒细胞分泌乳铁蛋白(lactoferrin,LTF)以及呼吸爆发的影响。5、Western Blot检测Pam3CSK4预处理后的中性粒细胞p38MAPK,AKT,ERK的磷酸化水平。6 p38MAPK抑制剂(SB202190),ERK抑制剂(PD98059),JNK抑制剂(SP600125),PI3K抑制剂(LY294002)处理GM-CSF诱导的中性粒细胞后,流式检测各抑制剂对Pam3CSK4预处理的中性粒细胞在对HK-MRSA的吞噬功能、呼吸爆发、以及乳铁蛋白产生的影响。结果:1、Pam3CSK4预处理的中性粒细胞对HK-MRSA的吞噬、杀菌抑菌功能显著增强,对HK-E.coil的吞噬、杀菌抑菌功能无显著差异。2、Pam3CSK4预处理增强了中性粒细胞对fMLP(N-Formyl-Met-LeuPhe,fMLP)的趋化能力。3、Pam3CSK4预处理6h和12h后,中性粒细胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、iNOS、COX2、LL37基因的表达显著增强;IL-6、IL-10、TNF-α的分泌也显著增加。4、随着Pam3CSK4浓度的升高,中性粒细胞乳铁蛋白表达量增多,呼吸爆发能力增强,且呈剂量依赖关系。5、Western Blot结果显示,Pam3CSK4预处理提高了中性粒细胞p38MAPK,AKT的蛋白磷酸化水平,并且呈时间和剂量依赖性,但是ERK的蛋白磷酸化水平并无显著改变。6、MAPK,PI3K通路抑制结果表明,SB202190和LY294002显著阻滞了Pam3CSK4预处理所致的中性粒细胞对HK-MRSA的吞噬功能;SB202190、LY294002、PD98059显著阻滞了Pam3CSK4预处理所致的中性粒细胞对HKMRSA的呼吸爆发功能;SB202190、LY294002、PD98059、SP600125均不同程度的抑制了Pam3CSK4所介导的中性粒细胞乳铁蛋白的产生。结论:1、Pam3CSK4预处理GM-CSF诱导中性粒细胞,增强了其对MRSA的吞噬、杀伤功能、趋化功能、释放乳铁蛋白以及呼吸爆发功能。2、Pam3CSK4预处理增强GM-CSF诱导中性粒细胞杀菌功能与Pam3CSK4激活中性粒细胞p38MAPK,AKT的磷酸化水平有关。