论文部分内容阅读
目的:本研究拟筛选出针对HPV-DNA的高效通用引物,并利用该引物检测循环HPV-DNA以进一步探讨其对于非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)患者的潜在风险,继而在此基础上初步探索microRNAs(miRNAs)在循环HPV-DNA阳性NSCLC患者血浆中的表达,分析异常表达miRNAs对于鉴定循环HPV-DNA阳性NSCLC的潜在价值。方法:1.通过比较6对通用引物检测9种常见型别HPV-DNA的效果,选取检测效果最佳的通用引物用于后续循环HPV-DNA筛选的实验中。2.纳入100例NSCLC患者,收集其外周血标本进行HPV-DNA检测,再使用HPV特异性巢氏引物方法和基因测序方法对其进行分型。3.结合患者的临床和病理资料,对血液循环中HPV-DNA的存在与NSCLC患者临床病理特征之间的关系进行统计分析。4.基于TCGA数据库初步筛选NSCLC中差异性表达明显的miRNAs。并采用实时荧光定量PCR方法分别检测循环HPV-DNA阳性NSCLC患者、循环HPV-DNA阴性NSCLC患者及健康对照组血浆中差异性miRNAs的表达水平。5.通过统计分析最终筛选出循环HPV-DNA阳性NSCLC患者血浆中异常表达的miRNAs。6.利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析不同miRNAs在鉴定循环HPV-DNA阳性NSCLC患者中的潜在价值。结果:1.在比较6对通用引物检测9种常见型别HPV-DNA中,通用引物SPF1/GP6++检测效果最佳。2.纳入研究的NSCLC患者外周血中HPV-DNA检出率达16%,并且检出型别均为HPV-16型。3.循环HPV16-DNA阳性NSCLC患者在肿瘤病理类型、分化程度、肿瘤分期和淋巴结转移方面与循环HPV16-DNA阴性NSCLC患者存在明显差异,而在肿瘤原发灶直径方面没有显著差异。具体地,循环HPV16-DNA阳性NSCLC患者中出现肺腺癌、低分化、晚期肺癌和淋巴结转移的的比例高于循环HPV16-DNA阴性NSCLC患者。4.基于TCGA数据库共初步筛选出8种差异性表达明显的miRNAs,其中,呈现上调的miRNAs共4个,分别是miR-183、miR-182、miR-210和miR-9-3,呈现下调的miRNAs共4个,分别为miR-144、miR-451a、miR-486-1和miR-486-2。5.经RT-qPCR验证分析后,发现miR-182、miR-183和miR-210在循环HPV16-DNA阳性NSCLC患者血浆中的表达量要显著高于循环HPV16-DNA阴性NSCLC患者,miR-144的表达量明显低于循环HPV16-DNA阴性NSCLC患者,其他miRNAs的表达量在循环HPV16-DNA阳性NSCLC患者与循环HPV16-DNA阴性NSCLC患者间无明显差异。6.当使用单项miRNA诊断循环HPV16-DNA阳性NSCLC患者时,血浆miR-183、miR-182、miR-210、和miR-144均具有一定的诊断价值。其中,miR-210的ROC曲线下面积(AUC)值最高,且其诊断的灵敏度和特异性均较高。当使用两种miRNAs进行联合检测时,其AUC值、灵敏度和特异性均一定程度上升高。其中,miR-210+miR-144的AUC值最高,诊断效果最好。结论:1.通用引物的PCR方法操作简便、高效迅速,可用于HPV-DNA的筛查,但通用引物筛查HPV-DNA的精确性还有待进一步考量,需优化或设计更加精准的通用引物。2.循环HPV-DNA与NSCLC患者的肿瘤病理类型、分化程度、临床分期和发生淋巴结转移存在密切联系,可能是NSCLC患者疾病恶性程度较高和预后不良的预警因子。3.血浆miR-183、miR-210、miR-182和miR-144可作为可靠的生物标志物辅助循环HPV16-DNA阳性NSCLC的诊断。两种miRNAs联合检测时,可提高其检测循环HPV16-DNA阳性NSCLC的效果。但仍需要增加更多的标本量来提高检测结果的准确性。具体的分子机制研究还有待开展进一步的实验。