论文部分内容阅读
第一部分杠柳次苷对结肠癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响目的:通过研究杠柳次苷（Periplocymarin,PPM）对结肠癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及相关标志蛋白表达等的影响,探讨PPM对结肠癌细胞的作用,为PPM应用于结肠癌的临床治疗提供科学依据。方法:1.CCK-8法检测不同浓度PPM分别作用不同时间,对结肠癌细胞株（HCT 116、SW480、RKO、HT-29）增殖活性的影响。2.应用流式细胞术（flow cytometry,FCM）和TUNEL荧光染色法检测不同浓度PPM对结肠癌细胞株HCT 116及RKO细胞凋亡的影响。3.应用Western blot技术检测PPM对HCT 116及RKO细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响。4.应用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测不同浓度PPM对结肠癌细胞株HCT 116及RKO周期分布的影响。5.应用Western blot技术检测PPM对HCT 116及RKO细胞周期相关蛋白表达的影响。结果:1.CCK-8法检测结果显示,PPM可抑制结肠癌细胞株（HCT 116、SW480、RKO、HT-29）的增殖活性,且在12.5～100 ng/ml剂量范围内,呈剂量依赖性（P＜0.05）。2.流式细胞术检测结果显示,在12.5～100 ng/ml剂量范围内,Annexin V-FITC表达阳性细胞比例和TUNEL染色阳性的细胞比例均与PPM药物呈现剂量依赖性（P＜0.05）,提示PPM对结肠癌细胞有诱导凋亡作用。3.Western blot结果显示,PPM可导致HCT 116及RKO细胞中促凋亡因子Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达明显升高（P＜0.05）,抗凋亡因子Bcl-2、survivin蛋白表达明显降低（P＜0.05）。4.流式细胞术结果显示,PPM 12.5～50 ng/ml剂量范围内,HCT 116及RKO细胞G0/G1期的比例明显增加（P＜0.05）,S期细胞比例明显减少（P＜0.05）,与PPM呈部分剂量依赖性。5.Western blot结果提示,PPM可导致HCT 116及RKO细胞中p21蛋白表达水平升高（P＜0.05）,cyclin D1蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论:PPM可通过抑制结肠癌细胞的增殖活性、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞于G0/G1期发挥抗癌作用。第二部分PPM对结肠癌细胞作用的机制研究目的:应用蛋白质组学,深入探讨PPM对结肠癌细胞的作用机制,为PPM应用于结肠癌的综合治疗提供科学依据。方法:1.应用50 ng/ml PPM处理结肠癌细胞HCT 116,TMT定量蛋白质组学技术分析,以倍数变化大于1.2倍（上调大于1.2倍或者下调小于0.83）且P值小于0.05的标准筛选差异表达蛋白质。2.采用生物信息学分析差异蛋白质的功能,对差异表达的蛋白质进行GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析,筛选出PPM可能作用的关键信号通路。3.采用Western blot技术检测PPM对HCT 116和RKO细胞IRS1、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表达的影响。结果:1.TMT定量蛋白质组学分析结果显示,鉴定到蛋白质总数6645个,PPM处理后差异表达蛋白总数539个,其中286个蛋白上调,253个蛋白下调。2.采用生物信息学分析差异蛋白质的功能,对差异表达的蛋白质进行GO功能富集分析,结果表明,相比于对照组,PPM导致的蛋白差异表达主要集中在动物器官形态发生等生物学过程、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、信号转导受体活性、分子转化子活性、跨膜受体蛋白激酶活性等分子功能,低密度脂蛋白颗粒等细胞组分。KEGG通路富集分析结果表明,有14条通路发生了显著变化,其中PI3K/Akt通路中富集的差异表达蛋白质数量最多,推测该通路可能参与PPM对结肠癌细胞的作用。3.PPM处理不能导致HCT 116和RKO细胞PI3K和Akt蛋白表达改变,但可导致IRS1、p-PI3K和p-Akt表达显著降低。鉴于该途径参与多种肿瘤细胞行为变化,且与细胞增殖和凋亡关系密切,因此推测PI3K/Akt通路参与了PPM对于结肠癌细胞增殖抑制和促凋亡的作用。小结:PPM对结肠癌细胞的作用与影响PI3K/Akt信号通路的活性有关,PPM可能通过抑制IRS1表达,进而抑制PI3K/Akt途径的活性,从而抑制结肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡。第三部分PPM抑制结肠癌细胞裸鼠移植瘤生长的作用及机制研究目的:构建结肠癌HCT 116细胞皮下荷瘤裸鼠模型,研究PPM在体内环境中对结肠癌细胞的抑制作用及机制,评估药物安全性,以探讨PPM治疗结肠癌的临床应用潜力。方法:1.构建HCT 116细胞皮下荷瘤BALB/c-nu裸鼠模型,当肿瘤体积达到100 mm~3时,将动物分为4组:对照组（CON,n=6）:每两天小鼠腹腔注射0.9%生理盐水200μl;PPM组（PPM,n=6）:每两天予以小鼠腹腔注射PPM（3 mg/kg,溶于200μl 0.9%生理盐水中）;氟尿嘧啶组（5-FU,n=6）:每两天予以小鼠腹腔注射氟尿嘧啶（10 mg/kg,溶于200μl 0.9%生理盐水中）;氟尿嘧啶组+PPM（5-FU+PPM,n=6）:每两天予以小鼠腹腔注射氟尿嘧啶（10 mg/kg）和PPM（3 mg/kg）（分别溶于100μl 0.9%生理盐水中）。给药21天后,通过脊柱脱位处死裸鼠。2.观察各组移植瘤的生长体积变化及瘤重。3.免疫组化技术观察各组裸鼠瘤组织中Bax、cleaved caspase-3、IRS1、p-PI3K、p-Akt的表达。4.由内眦静脉收集血液,行血常规和肝肾功能检测,HE染色观察心脏、肝脏、脾脏、肺组织和肾脏等重要脏器的病理改变以评价PPM对机体的毒副作用。结果:1.与对照组相比,5-FU组、PPM组和5-FU+PPM组肿瘤体积和重量均明显减小（P＜0.05）,其中联合治疗组的肿瘤体积和重量均小于5-FU组或PPM单药治疗组（P＜0.05）。PPM组动物的肿瘤体积和重量与5-FU组相比无统计学差异（P＞0.05）,提示PPM治疗与5-FU抗癌效果相当,5-FU与PPM联合用药可增强5-FU抗肿瘤效果。2.与对照组相比,PPM、5-FU以及5-FU+PPM处理均可以导致肿瘤组织中促凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3表达增加（P＜0.05）,而PI3K/Akt通路中的关键因子IRS1、p-PI3K、和p-Akt表达水平显著降低（P＜0.05）,表明PPM可在体内抑制PI3K/Akt通路,并促进结肠癌细胞凋亡。3.PPM治疗未导致动物血常规、肝肾功能的变化,5-FU治疗可导致动物出现白细胞数量减少以及丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平升高（P均＜0.05）,5-FU+PPM治疗可导致动物尿素氮水平明显升高（P＜0.05）,提示PPM可能减轻5-FU对肝功能和白细胞的损害,但二者联合用药可导致肾功能受损。4.HE染色结果显示,PPM组或5-FU+PPM组裸鼠的重要脏器均未发生明显结构和形态学改变。小结:在体内环境中,PPM可以抑制PI3K/Akt通路,增加肿瘤组织促凋亡蛋白表达,减少肿瘤体积,与5-FU联合应用可增强抗肿瘤作用,安全性好。结论:PPM可抑制结肠癌细胞PI3K/Akt信号通路活化,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制结肠癌细胞的生长。PPM在体内治疗剂量下对血液系统、肝肾功能损伤小,安全性好,且与5-FU联合应用可增强抗肿瘤作用。