脂肪酶催化水解反应过程中,脂肪酶除了可以活化水分子外,还可以活化过氧化氢分子。活化后的水分子或（过氧化氢分子）均可进攻脂肪酶-酯过渡态复合物（第二过渡态复合物）,并释放游离的脂肪酸（或过氧乙酸）。脂肪酶活化过氧化氢,合成过氧乙酸的催化活性即为脂肪酶的过水解催化活性。脂肪酶的过水解催化活性是脂肪酶的多功能催化活性之一;开发脂肪酶的过水解催化活性,实现酶法合成过氧乙酸,具有重要的经济价值和社会意义（安全生产）。反应体系或反应介质中存在的氧化剂（如过氧化氢）将破坏脂肪酶的结构,导致脂肪酶蛋白变性失活。通过半理性设计提高脂肪酶对过氧化氢的耐受性,降低过氧化氢对脂肪酶的结构和功能的消极影响,对进一步拓展脂肪酶的应用领域和应用价值,均具有重要的意义。本论文选用分子结构相对简单、分子结构中无二硫键,且具有良好生物安全性的Bacillus subtilis脂肪酶（缩写为LipA）作为研究对象。首选通过质谱分析和丙氨酸扫描,筛选出脂肪酶LipA对过氧化氢较为敏感的潜在氨基酸残基;之后经由定点突变和叠加突变进一步筛选出具有良好过氧化氢耐受性的突变体;分离纯化后的突变体蛋白,表征其酶学性质和过氧化氢耐受性数值,并与野生型脂肪酶进行比较;最终结合计算模拟和3D结构分析,阐述LipA突变体对过氧化氢耐受性提高的机理。具体实验结果如下:1、B.subtilis脂肪酶经过氧化氢处理后,经质谱分析,发现其分子量增加值为64,结合相关文献,可以推测:经过氧化氢处理后,脂肪酶分子中的甲硫氨酸残基和色氨酸残基被氧化。之后利用丙氨酸扫描对4个甲硫氨酸残基和2个色氨酸残基进行定点突变。经过筛选获得两个阳性突变体:LipA-W⁴²A和LipA-M¹³⁴A。2、通过定点突变将对过氧化氢不敏感的氨基酸残基（Ile、Val、Glu和Asp）分别替换Trp⁴²位点和Met¹³⁴位点,经过筛选获得5个良好的阳性突变体。对筛选到的阳性突变体进行叠加突变,构建Mini突变体库。经过氧化氢处理和酶学性质分析测定,叠加突变体的残余酶活相较于野生型皆有不同程度增强。其中,LipA-W⁴²I/M¹³⁴I、LipA-W⁴²I/M¹³⁴V、LipA-W⁴²A/M¹³⁴E和LipA-M¹³⁴A/W⁴²I对过氧化氢的耐受性提高最为显著。对上述四个叠加突变体及野生型脂肪酶进行亲和层析纯化,获得电泳纯的目的蛋白。以4-Nitrophenyl laurate为底物,测定相关酶学性质。经测定:野生型脂肪酶及四个叠加突变体(LipA-W⁴²A/M¹³⁴E、LipA-W⁴²I/M¹³⁴A、LipA-W⁴²I/M¹³⁴I和LipA-M¹³⁴I/W⁴²V)对过氧化氢的C₅₀值,分别为22 mmol/L、200 mmol/L、105 mmol/L、110 mmol/L和80 mmol/L。过氧化氢失活的半衰期,分别为24 min、3.8 h、27 min、36 min和30 min。3、Gromacs软件分析表明:脂肪酶在过氧化氢/水混合系统,较单纯的水系统,其RMSD值和RMSF值增大。对过氧化氢与氨基酸残基接触值的分析中发现:Trp⁴²位点的接触值最高。Trp⁴²突变为Ala⁴²(或Ile⁴²)后相应的接触值显著降低。Amber软件分析表明:四个叠加突变体的RMSD值相较于野生型皆有不同程度的降低。YASARA软件分析表明:LipA-M¹³⁴E产生盐桥效应,而LipA-M¹³⁴A、LipA-M¹³⁴I、LipA-M¹³⁴V通过减少疏水表面积促进氧化耐受性提高。