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背景 局麻药布比卡因（bupivacaine,bup）被广泛地应用于临床麻醉与镇痛,在临床上发挥着十分重要的作用。但是局麻药的神经毒性也给患者带来精神和身体上的困扰,严重制约着患者的生活质量。因此,由局麻药带来的这些问题也就十分值得麻醉医生及相关人员的重视。转录因子p53具有诱导细胞周期阻滞、促进DNA修复和凋亡,以修复或清除DNA损伤的功能,在很多真核生物的发生、发育、生长、代谢、疾病和衰老方面都有着很重要的作用。长链非编码RNATUG1（taurine upregulated gene 1）参与了神经发育、中枢神经系统病变,但在外周神经损伤中的作用尚未可知。有研究显示TUG1与p53的作用有着很强的的相关性,在某些情况下TUG1就是蛋白下游的一个靶基因。当前p53在神经损伤或修复方面的研究主要集中在中枢神经系统,而在外周神经损伤方面的作用报道非常少。关于TUG1的研究也多集中在肿瘤领域,鲜有在DNA损伤修复方面的报道。那么在椎管内麻醉时,如果bup引起小鼠DRG细胞损伤,是否也会引起DNA的损伤,从而引起p53依赖性的通路的DNA损伤性（DNA damage response,DDR）反应,进而进行DNA的修复呢?本研究想从基因层面来探索p53/TUG1通路在bup致小鼠DRG损伤的过程中发挥的作用,以期在局麻药神经毒性的防治方面提供参考信息。目的 1、检测bup对小鼠DRG细胞DNA的损伤作用2、探索p53/TUG1在bup导致DRG细胞DNA损伤中的作用3、探索p53/TUG1在bup致DRG细胞DNA损伤的作用机制方法1、取C57/BL6J幼鼠DRG做原代培养,用不同浓度的bup处理3小时后用CCK-8检测细胞活性,通过计算IC50值,得到最佳处理细胞的bup浓度。再用该浓度的bup来处理DRG细胞,用Annexin V-FITC实验检测细胞凋亡,用慧星实验检测DNA损伤状况,western bloot检测DNA损伤相关蛋白p-H2AX蛋白的表达,以验证布比卡因对DNA及细胞的损伤情况。用DNA修复关键酶DNA-PK抑制剂nu7441处理细胞后再用bup处理细胞,再次用彗星实验检测DNA损伤,CCK-8实验检测细胞活力的变化,确定bup通过引起DNA损伤来加重bup对小鼠DRG细胞的损伤。2、bup处理细胞后,提取蛋白及RNA,检测p53的表达情况。用siRNA敲低p53的表达后再用布比卡因处理,再次用彗星实验检测DNA损伤,CCK-8检测细胞活力的变化,以证明p53与DNA及细胞损伤之间的关系;检测TUG1基因表达水平,看p53表达变化对TUG1表达的影响。3、信息检索p53与TUG1之间的相互作用关系,再通过1ncRNATUG1荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）联合 p53 蛋白免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验在用bup处理过的小鼠DRG细胞中验证p53和TUG1表达的位置关系。4、qPCR检测布比卡因处理DRG细胞后TUG1的表达以及p53被敲低后TUG1的表达。用siRNA敲低TUG1后再用布比卡因处理,彗星实验检测DNA损伤,CCK-8检测细胞活力的变化,以确定TUG1对布比卡因引起的DNA损伤与细胞损伤之间的关系。5、对小鼠鞘内注射布比卡因或生理盐水后30分钟后后取腰骶段DRG组织,然后提取蛋白及RNA,western blot对p53蛋白及DNA损伤标志性蛋白进行检测,qPCR对和lncRNA TUG1的表达进行检测,从另一个角度来验证p53和TUG1跟bup致小鼠DRG细胞DNA损伤的相关性。结果1、布比卡因会引起细胞活力呈浓度依赖性下降,加重细胞凋亡,并加重DNA损伤。2、当DNA修复性关键酶DNA-PK被抑制后,布比卡因引起的DNA损伤及细胞损伤会加重。3、布比卡因会引起p53基因表达上调。当p53被siRNA敲低后,布比卡因引起的DNA及细胞损伤会加重。4、p53被敲低后,TUG1的表达也会下降。信息检索显示p53与TUG1的启动子有可能结合的位点。在小鼠细胞内p53和TUG1有共同的表达位点。5、布比卡因也会引起lncRNATUG1下调。lncRNA被siRNA敲低后,布比卡因引起的DNA及细胞损伤也会加重。6、小鼠鞘内注射布比卡因会引起DRG细胞p53和lncRNA TUG1表达的增加。结论1、布比卡因有神经毒性,可引起小鼠DRG细胞以及DNA损伤。2、布比卡因引起的小鼠DNA损伤会激活p53依赖性通路的DNA损伤反应,并进行DNA修复。3、在小鼠DRG细胞的DNA损伤反应中,p53可能以lncRNATUG1为下游靶点,参与DNA修复,减轻DNA损伤以减轻细胞损伤。