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新城疫和禽流感是全球禽类重要的传染性疾病,如不采取严格、有效的控制措施,可迅速引起动物发病和死亡,给养禽业造成重大经济损失。目前这两种疾病可通过疫苗接种来预防和控制。但常用的灭活苗佐剂(如油乳和铝盐)通常会引起较强的局部反应,包括疼痛、炎症等,或不能增强抗原的免疫原性。因此,需要研究和开发新型、高效、低毒的免疫佐剂。
日本血凝病毒(Hemagglutinating virus of Japan,HVJ)亦称仙台病毒,是一种具有血凝性和高效膜融合功能的包膜病毒,经紫外线灭活失去感染性的病毒囊膜(Hemagglutinating virus of Japan Envelope,HVJ-E)具有双重的免疫调节作用,可以同时促进先天性免疫反应和获得性免疫反应。许多研究证明,HVJ-E可刺激树突状细胞(Dendritic cell,DC)成熟,并刺激DC产生IFNs和IL-6等细胞因子,其中IL-6能抑制调节性T细胞的活化,促进效应性T细胞和NK细胞的产生,阻止IL-10、TGF等免疫抑制性细胞因子的分泌,具有明显的免疫增强作用。但HVJ-E直接作为免疫佐剂的研究尚未见报道,因此,本研究通过将HVJ-E分别与新城疫或禽流感H9N2灭活苗共同免疫,从抗体产生水平,细胞因子激发水平和经病毒攻击后的保护水平三个方面来研究HVJ-E的免疫佐剂特性。研究主要从以下三个方面进行探讨:
(1)HVJ-E诱导小鼠骨髓树突状细胞成熟的研究:体外分离培养C57BL/6小鼠骨髓树突状细胞(murine marrow-derived dendritic cell,mDC),清洗细胞悬液,离心取细胞沉淀(2×106)铺6孔板,并加50 ng/mL鼠重组GM-CSF和IL-4,5 d后弃去悬浮细胞,收集半贴壁的未成熟的树突状细胞。DC经HVJ-E刺激48 h后,ELISA检测各组DC上清中细胞因子的分泌水平,流式细胞仪测定DC细胞表面分子的表达率。ELISA检测结果显示,相对于PBS刺激组,经HVJ-E刺激后DC所分泌的IFN-β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达水平显著升高;流式细胞仪分析显示HVJ-E刺激的DC引起细胞表面的共刺激分子CD40、CD80、MHC II和CD11c也呈现较高水平表达;研究结果充分说明了HVJ-E可以刺激小鼠树突状细胞的成熟化和细胞因子的分泌。
(2)HVJ-E作为新城疫灭活苗免疫佐剂的研究:将SPF鸡随机分为四组,每组20只,分别为灭活苗(KV)组、HVJ-E(1.5×109)+KV组、HVJ-E(1.5×109)组和PBS组。分别于免疫后7 d、14 d、21 d翅静脉采血,分离血清并测定抗体水平;免疫后21 d以ND强毒进行攻毒,攻毒后2 d、4 d、7 d、10 d采集口咽腔、泄殖腔棉拭子,接种SPF鸡胚,分离病毒;统计分析HVJ-E对ND灭活苗的免疫促进作用。结果显示,HVJ-E+KV组的抗体水平较灭活苗(KV)组显著提高(p＜0.05);攻毒结果显示,HVJ-E+KV组能使被免疫鸡完全保护且没有排毒。研究结果提示,HVJ-E可以作为NDV灭活苗的免疫佐剂。
(3)HVJ-E作为禽流感H9亚型灭活苗免疫佐剂的研究:将SPF鸡随机分为四组免疫,分组及免疫方式同前。免疫后7 d、14 d、21 d采血,分离血清,测定抗体水平和细胞因子水平;免疫后14 d、21 d,分离淋巴细胞,提取RNA,半定量RT-PCR检测IFN-γ和IFN-β的表达水平;免疫后21 d鼻内攻毒,攻毒后2 d、4 d、7 d、10 d采集口咽腔、泄殖腔棉拭子,接种SPF鸡胚,分离病毒;统计分析HVJ-E对H9灭活苗的免疫促进作用。结果显示,免疫后7 d,HVJ-E+KV组和KV组可检测到特异性抗体,但两组间没有明显差异;免疫后14 d和21 d,HVJ-E+KV组比KV组的抗体水平要高,且差异显著(p＜0.05);HVJ-E组和HVJ-E+KV组细胞因子的mRNA表达水平比PBS组和KV组的高;攻毒结果显示,PBS组的阳性分离率要比其他组高(p＜0.05),且各组都没有死亡,HVJ-E+KV组比KV组的病毒分离率降低(p＜0.05),HVJ-E+KV组免疫鸡完全受到保护。以上结果表明HVJ-E能够刺激机体产生更好的免疫保护,可作为灭活苗的免疫佐剂。