非霍奇金淋巴瘤（NHL）是淋巴系统来源的恶性肿瘤，其中85%来源于B细胞，在我国占整个肿瘤发生的4%。Rituximab是1997年美国FDA第一个批准用于癌症治疗的单克隆抗体（mAb），已经彻底改变了B细胞淋巴瘤的治疗现状，明显地提高了NHL患者的中位生存时间。但是在临床应用中，仍有部分患者对Rituximab的治疗不反应或者产生耐药，因此具有更高特异性和更低免疫原性的抗体是非霍奇金淋巴瘤临床治疗的迫切需要。NHL具有多种形态特征、免疫表型和生物学规律，对治疗产生的反应也各不相同。研究表明，在临床治疗中可通过应用单克隆抗体或双特异性抗体联合治疗来阻断多个靶点，从而实现改进治疗效果的目的。目前，迫切需要设计具有较好抗肿瘤活性的双特异性抗体来有效地治疗非霍奇金淋巴瘤。耐药是治疗肿瘤的难点之一。在肿瘤发生发展的早期阶段往往耐药基因已经开始发生变化，导致caspase依赖的细胞凋亡途径的缺陷，使耐药的肿瘤细胞具有更快的生长速度和更强的存活能力。肿瘤治疗过程中化疗药物往往促使多药耐药基因（MDR）的表达，所以能够促进细胞凋亡并能有效杀伤耐药肿瘤细胞的细胞死亡途径已成为癌症研究人员关注的热点。溶酶体可以被视为肿瘤细胞的一个弱点，可用于选择性地杀死癌细胞，这已被证明是杀死耐药肿瘤细胞并使耐药肿瘤细胞重新对药物敏感的有效途径。研究表明，HLA-DR可作为诱导由溶酶体介导的肿瘤细胞死亡的一种理想的靶标，但HLA-DR在正常细胞中也有表达，于是人们提出了关于临床应用HLA-DR抗体的安全性问题。抗-HLA-DR抗体hL243γ1在治疗淋巴瘤和白血病方面不仅能诱导较强的溶酶体介导的细胞死亡，而且与Rituximab联合应用后能够显著增加Rituximab对肿瘤的抗增殖作用。本研究中，我们在crossover和knobs-into-holes技术的基础上，将Rituximab单抗（抗CD20）和hL243Yl单抗（抗HLA-DR）作为亲本抗体,构建了双特异性抗体CD20-243CrossMab，可同时靶向CD20分子和HLA-DR分子,它是结构非常接近天然Y型IgG抗体分子的二价双特异性抗体，并可大量表达于普通哺乳动物细胞瞬时表达系统。为了验证CD20-243CrossMab的抗肿瘤作用，我们研究了CD20-243CrossMab与CHO-CD20+细胞的结合活性，与CD20阴性的namalwa细胞的结合活性；CD20-243CrossMab对肿瘤细胞Raji细胞、CDH-CD20+细胞和namalwa细胞的CDC效应、ADCC效应和生长抑制作用。随后我们研究了Caspase抑制剂对CD20-CrossMab诱导细胞凋亡的影响，并用激光共聚焦显微镜进行了CD20-243CrossMab导致Raji细胞溶酶体破裂实验和Cathepsin抑制剂抑制CD20-CrossMab诱导肿瘤细胞凋亡能力的实验，验证了CD20-243CrossMab是通过溶酶体通路诱导肿瘤细胞的死亡。我们还研究了CD20-243CrossMab抗体对淋巴瘤耐药细胞的抗肿瘤作用，并用该抗体进行了小鼠体内实验，发现接种肿瘤后CD20-243CrossMab明显延长了SCID小鼠的存活时间。实验结果表明，CD20-243CrossMab可显著诱导非霍奇金淋巴瘤细胞的死亡，并对Rituximab耐药的B细胞淋巴瘤具有较强的抗肿瘤作用。更重要的是，尽管在恶性肿瘤中HLA-DR没有特异性表达，但CD20-243CrossMab对CD20和HLA-DR阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞却能够表现出特异的抗肿瘤活性。