论文部分内容阅读
本研究拟以正常和抑郁症模型大鼠为主要研究对象，在验证百合知母汤抗抑郁作用的基础上，同时以多种可原型入血的单体化合物作为主要考察指标，研究百合知母汤药代动力学受组方和疾病改变的特征;在此基础上，本课题还将首次开展抑郁状态下百合知母汤的代谢组学研究，寻找有潜在科学意义的生物标志物和代谢通路。本研究的结果可有助于解释百合知母汤发挥抗抑郁疗效与活性成分间的量化关系，佐证该经典组方的科学性和合理性，为百合知母汤在临床的合理应用提供新的证据，研究的结果也将会有助于进一步阐明百合知母汤抗抑郁药理作用的机制。
研究目的:
1、建立慢性不可预见性轻度应激联合孤养的抑郁症大鼠模型，验证百合知母汤抗抑郁的药效学作用。
2、建立同时测定大鼠血浆中新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的UPLC-MS/MS定量方法。
3、研究单次灌胃百合知母汤提取液和单味药材提取液后，上述7种有效成分在正常大鼠体内的药代动力学特征，考察配伍前后药代动力学参数的变化，探讨组方的科学性和合理性。
4、比较单次灌胃百合知母汤提取液后，上述7种有效成分在抑郁症模型大鼠和正常大鼠体内的药代动力学特征。
5、利用代谢组学方法研究百合知母汤发挥抗抑郁作用的可能途径，并探讨抑郁状态对主要成分药动学参数改变可能的原因。
研究方法:
1、大鼠抑郁症疾病模型的构建与百合知母汤组方抗抑郁药效的研究
采用慢性不可预见性轻度应激联合孤养的方法，建立抑郁症大鼠模型，以体重增量、糖水偏好度、旷场实验和高架十字迷宫实验的行为学改变等指标评估模型是否构建成功。建模的同时，连续6周每日灌胃百合知母汤(12g/kg)予以干预，并以经典抗抑郁药氟西汀(10mg/kg)为阳性对照，验证百合知母汤的抗抑郁作用。
2、以UPLC-MS/MS同时定量百合知母汤中多个组分的方法的建立
利用超高效液相色谱结合Qtrap5500三重四级杆技术，建立同时检测大鼠血浆中新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的UPLC-MS/MS定量方法，依据FDA对于生物制品定量分析的指导原则，对方法的专属性、线性、精密度、准确度、稳定性、提取回收率和基质效应进行考察。
3、百合知母汤组方与单味药材在正常大鼠体内的比较药动学研究
利用已建立的UPLC-MS/MS定量方法，测定上述7种有效成分在百合知母汤、知母药材和百合药材提取液中的含量，比较单次灌胃百合知母汤提取液（12g/kg，相当于22.45mg/kg新芒果苷、40.30mg/kg芒果苷、46.30mg/kg王百合苷A、48.20mg/kg王百合苷Ⅰ、129.15mg/kg皂苷BⅡ、6.10mg/kg皂苷E和28.70mg/kg皂苷AⅢ）、知母药材提取液（3g/kg，相当于22.10mg/kg新芒果苷、20.65mg/kg芒果苷、77.65mg/kg皂苷BⅡ、4.25mg/kg皂苷E和17.25mg/kg皂苷AⅢ）和百合药材提取液(9g/kg，相当于38.10mg/kg王百合苷A和40.15mg/kg王百合苷Ⅰ)后，上述7种有效成分在正常大鼠体内的药代动力学参数。
4、百合知母汤组方中7个代表性成分在抑郁症模型大鼠与正常大鼠体内的比较药动学研究
利用已建立的UPLC-MS/MS定量方法，比较单次灌胃12g/kg百合知母汤提取液后，上述7种有效成分在抑郁症模型大鼠和正常大鼠体内的药代动力学特征。
5、以代谢组学的方法研究百合知母汤的主要抗抑郁机制，并探讨抑郁状态改变主要化合物药动学参数的原因。
利用TripleTOF4600高分辨质谱检测正常组、抑郁症模型组、百合知母汤组和氟西汀组大鼠6周内的血清样品，借助PLS-DA等多元统计分析方法，筛选百合知母汤发挥抗抑郁作用的可能通路，并通过相关生物标志物的分析，探讨抑郁状态造成药物药动学参数改变的可能原因。
研究结果:
1.成功建立慢性不可预见性轻度应激联合孤养大鼠抑郁症模型。同时连续6周给予百合知母汤(12g/kg)后，百合知母汤可增加模型组大鼠体重和糖水偏好度(p＜0.05);提高旷场实验中的移动总距离和速率(p＜0.05);降低高架十字迷宫实验中的闭臂停留时长和进入闭臂次数(p＜0.05)。提示百合知母汤具有较好的抗抑郁作用，与阳性对照药氟西汀疗效无显著性差异。
2.成功建立了以UPLC-MS/MS同时检测百合知母汤中7种有效成分血药浓度的方法，实现了单针10min对7种有效成分的灵敏检测，各成分的最低定量限在0.1-1.0ng/mL间，可满足7种有效成分在大鼠体内药动学研究的需求。
3.百合知母汤组方后，芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ在百合知母汤提取液中的含量分别比单味药材提取液增加了95.16％、21.52％、20.05％、66.32％、43.53％和66.38％(p＜0.05)。组方与单味药材相比，新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的AUC0-24分别增加了20.73％、127.55％、45.58％、41.96％、45.99％、67.14％、93.72％(p＜0.05);AUC0-∞分别增加了20.87％、127.77％、44.71％、50.32％、46.02％、67.78％和90.79％(p＜0.05);Cmax分别增加了14.42％、127.57％、50.61％、24.13％、51.67％、87.40％和85.87％(p＜0.05)。
4.单次灌胃百合知母汤提取液后，抑郁症模型组大鼠与正常组大鼠相比，新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的AUC0-24分别降低了73.73％、71.98％、73.05％、63.75％、76.40％、69.20％和73.04％(p＜0.05);AUC0-∞分别降低了70.59％、71.89％、71.10％、63.71％、76.23％、68.94％、和73.12％(p＜0.05);Cmax分别降低了80.01％、75.26％、74.51％、58.92％、76.12％、83.33％和70.57％(p＜0.05);CLz/F分别增加了192.16％、213.48％、246.63％、175.56％、319.54％、192.63％和223.68％(p＜0.05)。
5.利用代谢组学方法鉴别出与抑郁症相关的43种潜在的血清生物标志物，它们涉及脂肪酸β氧化、脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、甘氨酸代谢、乙醇胺代谢和脂质代谢通路。其中卡尼汀类的Propionyl carnitine（丙酰卡尼丁）、Vaccenyl carnitine，脂肪酰胺类的Palmitic amide（棕榈酰胺）以及甘氨酸衍生物Alanyl glycine属本研究首次报道。百合知母汤可纠正其中24个生物标志物的水平异常，通过作用于脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、甘氨酸代谢和脂质代谢通路4条代谢通路协同发挥抗抑郁作用，而阳性药物氟西汀经分析，只对甘氨酸代谢和糖脂代谢2条代谢通路的影响较大。由于花生四烯酸和亚油酸的代谢改变可影响CYP450酶活性和肾血液动力学以及管状运输过程，因此推测百合知母汤在抑郁状态下药动学参数的改变与疾病状态下花生四烯酸和亚油酸的代谢改变有关，为阐明抑郁症疾病状态对药物的影响机制提供了线索。
研究结论:
1、以本研究成功建立的抑郁症大鼠模型为对象，百合知母汤(12g/kg)和氟西汀(10mg/kg)的抗抑郁效果无显著性差异。
2、建立了同时检测百合知母汤中7种有效成分血药浓度的UPLC-MS/MS方法，方法准确、灵敏、可靠、重复性好。
3、百合知母汤组方与单味药材相比，在有效成分体外提取过程和体内药动学特征上更具优势，其组方后的药效物质基础不是单味药材有效成分的简单加和，表明该组方具有科学性和合理性。
4、本课题首次发现，与正常组大鼠相比，7种有效成分在抑郁症模型组大鼠体内呈现吸收减少和消除增加的特征。结果提示临床使用百合知母汤进行抑郁症治疗的时候，需要充分考虑抑郁症病情的具体变化，调整给药剂量等以达到预期治疗目的，避免治疗未达到预期疗效。
5、百合知母汤对代谢通路的影响可覆盖，且并不局限于已知的氟西汀对甘氨酸和糖脂代谢等通路的影响，研究还发现了其对脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、磷脂代谢等通路的影响，而抑郁状态下百合知母汤7种有效成分药动学参数改变可能与花生四烯酸和亚油酸代谢异常有关。
研究目的:
1、建立慢性不可预见性轻度应激联合孤养的抑郁症大鼠模型，验证百合知母汤抗抑郁的药效学作用。
2、建立同时测定大鼠血浆中新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的UPLC-MS/MS定量方法。
3、研究单次灌胃百合知母汤提取液和单味药材提取液后，上述7种有效成分在正常大鼠体内的药代动力学特征，考察配伍前后药代动力学参数的变化，探讨组方的科学性和合理性。
4、比较单次灌胃百合知母汤提取液后，上述7种有效成分在抑郁症模型大鼠和正常大鼠体内的药代动力学特征。
5、利用代谢组学方法研究百合知母汤发挥抗抑郁作用的可能途径，并探讨抑郁状态对主要成分药动学参数改变可能的原因。
研究方法:
1、大鼠抑郁症疾病模型的构建与百合知母汤组方抗抑郁药效的研究
采用慢性不可预见性轻度应激联合孤养的方法，建立抑郁症大鼠模型，以体重增量、糖水偏好度、旷场实验和高架十字迷宫实验的行为学改变等指标评估模型是否构建成功。建模的同时，连续6周每日灌胃百合知母汤(12g/kg)予以干预，并以经典抗抑郁药氟西汀(10mg/kg)为阳性对照，验证百合知母汤的抗抑郁作用。
2、以UPLC-MS/MS同时定量百合知母汤中多个组分的方法的建立
利用超高效液相色谱结合Qtrap5500三重四级杆技术，建立同时检测大鼠血浆中新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的UPLC-MS/MS定量方法，依据FDA对于生物制品定量分析的指导原则，对方法的专属性、线性、精密度、准确度、稳定性、提取回收率和基质效应进行考察。
3、百合知母汤组方与单味药材在正常大鼠体内的比较药动学研究
利用已建立的UPLC-MS/MS定量方法，测定上述7种有效成分在百合知母汤、知母药材和百合药材提取液中的含量，比较单次灌胃百合知母汤提取液（12g/kg，相当于22.45mg/kg新芒果苷、40.30mg/kg芒果苷、46.30mg/kg王百合苷A、48.20mg/kg王百合苷Ⅰ、129.15mg/kg皂苷BⅡ、6.10mg/kg皂苷E和28.70mg/kg皂苷AⅢ）、知母药材提取液（3g/kg，相当于22.10mg/kg新芒果苷、20.65mg/kg芒果苷、77.65mg/kg皂苷BⅡ、4.25mg/kg皂苷E和17.25mg/kg皂苷AⅢ）和百合药材提取液(9g/kg，相当于38.10mg/kg王百合苷A和40.15mg/kg王百合苷Ⅰ)后，上述7种有效成分在正常大鼠体内的药代动力学参数。
4、百合知母汤组方中7个代表性成分在抑郁症模型大鼠与正常大鼠体内的比较药动学研究
利用已建立的UPLC-MS/MS定量方法，比较单次灌胃12g/kg百合知母汤提取液后，上述7种有效成分在抑郁症模型大鼠和正常大鼠体内的药代动力学特征。
5、以代谢组学的方法研究百合知母汤的主要抗抑郁机制，并探讨抑郁状态改变主要化合物药动学参数的原因。
利用TripleTOF4600高分辨质谱检测正常组、抑郁症模型组、百合知母汤组和氟西汀组大鼠6周内的血清样品，借助PLS-DA等多元统计分析方法，筛选百合知母汤发挥抗抑郁作用的可能通路，并通过相关生物标志物的分析，探讨抑郁状态造成药物药动学参数改变的可能原因。
研究结果:
1.成功建立慢性不可预见性轻度应激联合孤养大鼠抑郁症模型。同时连续6周给予百合知母汤(12g/kg)后，百合知母汤可增加模型组大鼠体重和糖水偏好度(p＜0.05);提高旷场实验中的移动总距离和速率(p＜0.05);降低高架十字迷宫实验中的闭臂停留时长和进入闭臂次数(p＜0.05)。提示百合知母汤具有较好的抗抑郁作用，与阳性对照药氟西汀疗效无显著性差异。
2.成功建立了以UPLC-MS/MS同时检测百合知母汤中7种有效成分血药浓度的方法，实现了单针10min对7种有效成分的灵敏检测，各成分的最低定量限在0.1-1.0ng/mL间，可满足7种有效成分在大鼠体内药动学研究的需求。
3.百合知母汤组方后，芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ在百合知母汤提取液中的含量分别比单味药材提取液增加了95.16％、21.52％、20.05％、66.32％、43.53％和66.38％(p＜0.05)。组方与单味药材相比，新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的AUC0-24分别增加了20.73％、127.55％、45.58％、41.96％、45.99％、67.14％、93.72％(p＜0.05);AUC0-∞分别增加了20.87％、127.77％、44.71％、50.32％、46.02％、67.78％和90.79％(p＜0.05);Cmax分别增加了14.42％、127.57％、50.61％、24.13％、51.67％、87.40％和85.87％(p＜0.05)。
4.单次灌胃百合知母汤提取液后，抑郁症模型组大鼠与正常组大鼠相比，新芒果苷、芒果苷、王百合苷A、王百合苷Ⅰ、皂苷BⅡ、皂苷E和皂苷AⅢ的AUC0-24分别降低了73.73％、71.98％、73.05％、63.75％、76.40％、69.20％和73.04％(p＜0.05);AUC0-∞分别降低了70.59％、71.89％、71.10％、63.71％、76.23％、68.94％、和73.12％(p＜0.05);Cmax分别降低了80.01％、75.26％、74.51％、58.92％、76.12％、83.33％和70.57％(p＜0.05);CLz/F分别增加了192.16％、213.48％、246.63％、175.56％、319.54％、192.63％和223.68％(p＜0.05)。
5.利用代谢组学方法鉴别出与抑郁症相关的43种潜在的血清生物标志物，它们涉及脂肪酸β氧化、脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、甘氨酸代谢、乙醇胺代谢和脂质代谢通路。其中卡尼汀类的Propionyl carnitine（丙酰卡尼丁）、Vaccenyl carnitine，脂肪酰胺类的Palmitic amide（棕榈酰胺）以及甘氨酸衍生物Alanyl glycine属本研究首次报道。百合知母汤可纠正其中24个生物标志物的水平异常，通过作用于脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、甘氨酸代谢和脂质代谢通路4条代谢通路协同发挥抗抑郁作用，而阳性药物氟西汀经分析，只对甘氨酸代谢和糖脂代谢2条代谢通路的影响较大。由于花生四烯酸和亚油酸的代谢改变可影响CYP450酶活性和肾血液动力学以及管状运输过程，因此推测百合知母汤在抑郁状态下药动学参数的改变与疾病状态下花生四烯酸和亚油酸的代谢改变有关，为阐明抑郁症疾病状态对药物的影响机制提供了线索。
研究结论:
1、以本研究成功建立的抑郁症大鼠模型为对象，百合知母汤(12g/kg)和氟西汀(10mg/kg)的抗抑郁效果无显著性差异。
2、建立了同时检测百合知母汤中7种有效成分血药浓度的UPLC-MS/MS方法，方法准确、灵敏、可靠、重复性好。
3、百合知母汤组方与单味药材相比，在有效成分体外提取过程和体内药动学特征上更具优势，其组方后的药效物质基础不是单味药材有效成分的简单加和，表明该组方具有科学性和合理性。
4、本课题首次发现，与正常组大鼠相比，7种有效成分在抑郁症模型组大鼠体内呈现吸收减少和消除增加的特征。结果提示临床使用百合知母汤进行抑郁症治疗的时候，需要充分考虑抑郁症病情的具体变化，调整给药剂量等以达到预期治疗目的，避免治疗未达到预期疗效。
5、百合知母汤对代谢通路的影响可覆盖，且并不局限于已知的氟西汀对甘氨酸和糖脂代谢等通路的影响，研究还发现了其对脂肪酸酰胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、磷脂代谢等通路的影响，而抑郁状态下百合知母汤7种有效成分药动学参数改变可能与花生四烯酸和亚油酸代谢异常有关。