茉莉花茶是我国的特种茶,属再加工茶,由茶坯通过吸附茉莉花的香气(窨制)而制成的,深受消费者的青睐,具有广阔的市场前景。茉莉花(Jasminum Sambac(L).Ait)属木犀科(Oleaceae)素馨属(Jasminum)的夜间开花植物,其花瓣开放与释香相伴发生,香气独特且浓郁,是窨制花茶的主要原料,具有较高的经济价值。探究茉莉花开放与释香的分子机制,可为合理安排采花时间、花茶窨制的选择、花香的科学合理调控以及茉莉花开放与释香的遗传改良提供理论依据,具有重要的理论价值和实践意义。本研究采用GC-MS技术,检测茉莉花活体开放过程和离体养护过程中香气成分的含量及其变化;从双瓣茉莉花花瓣转录组数据中,挖掘茉莉花实时荧光定量PCR分析中的最佳内参基因;以未开放未释香茉莉花的花瓣(Driver)与开放并释香茉莉花的花瓣(Tester)为材料,构建DSN介导-抑制差减杂交cDNA文库,采用反向Northern-Blotting筛选该cDNA文库,获得阳性克隆,采用荧光定量PCR技术,确认含差异基因cDNA的阳性克隆,并对这些阳性克隆的测序结果进行生物信息学分析,预测其功能;采用荧光定量PCR技术检测香气形成相关基因在茉莉花活体开放过程和离体养护过程花瓣中表达量的动态变化,主要研究结果如下:1.茉莉花活体开放和离体养护过程中香气组分的动态变化:采用GC-MS技术,对茉莉花活体开放过程以及离体养护过程中的挥发性香气组分进行定量分析,结果表明,茉莉花活体与离体的香气组分基本一致,主要有:乙酸苄酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸顺-3-己烯酯、α-法尼烯和水杨酸甲酯等;活体开放过程中,挥发性香气成分,随着花瓣的开放,其含量逐渐升高,到凌晨00:00时达到最高;65%的香气成分在离体养护8h时,达到最高;在活体开放过程和离体养护过程中,α-法尼烯的含量均较高,分别在活体00:00时及离体8小时达到释放高峰;在活体开放过程中大根香叶烯含量较低,而在离体养护过程中较高。2.茉莉花荧光定量PCR检测的最佳内参基因的筛选:从茉莉花转录组数据库中钓出的13个看家基因,以茉莉的根、茎、叶和不同开放时期的花瓣的总RNA为模板,合成cDNA第一链,进行实时荧光定量PCR分析;采用Genorm、NormFinder、Bestkeeper三个软件进行稳定性评价,结果表明,Js18s2是茉莉花实时荧光定量PCR分析中的最佳内参基因。3.构建并筛选DSN介导-抑制消减cDNA文库,获得了若干与茉莉花香气形成相关的基因:DSN最适的处理浓度为1/4 U,差异cDNA扩增的最适循环数为19,差异cDNA扩增产物集中在750～2000bp,弥散没有出现亮带,说明DSN处理能有效去除高表达量和相同基因的cDNA,达到差减和均一化的效果,电转化结果表明,所构建的抑制差减杂交cDNA文库的滴度为1.5×106 cfu/mL;菌液PCR结果表明,每个克隆均有插入片段,且插入片段大小在750bp～2000bp之间,平均插入片段大小约为1000bp。涵盖了绝大多数植物基因全长cDNA的大小范围。采用反向Northern-Blotting技术筛选出142个阳性克隆,阳性率为29.89%;阳性克隆测序结果表明,在139条有效核苷酸序列中,有131条为单基因(占94.2%),冗余率为5.7%;使用BLAST2GO对所获得的131个差异基因进行聚类分析,结果表明,在初级代谢途径中,47.3%参与细胞组成,26.7%参与分子功能,26.0%参与生物进程;将这131个差异基因与拟南芥数据库和NR数据库进行比对,找到了 4个与香气代谢直接相关的基因:萜类合成酶(TPS)、大根香叶烯合酶(GDS)、脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)和苯甲醇苯乙酰基转移酶(BEBT),有5个参与光周期调控开花的CONSTANS-LIKE(CO)以及7个和激素调节与响应相关的基因,其中4个为乙烯应答转录因子。4.茉莉花香气形成相关基因(JsDXR、JsGDS、JsTPS和JsBEBT)的生物信息学分析及荧光定量分析:阳性克隆的测序结果表明,(1)JsDXR的cDNA全长为1641bp,包含1436 bp的ORF,编码461个氨基酸,在氨基酸序列上与茶树、芝麻、番茄、杜仲和猕猴桃的同源性均高于88%,实时荧光定量结果表明,JsDXR在尚未开放(18:00)时的表达量较低,到20:00时表达量最高,是18:00时的2倍,而后逐渐降低;JsDXR的相对表达量在离体0h时较低,以后持续升高,到离体16h时达到最高,是离体0h的10倍。(2)JsGDS的cDNA全长为1773 bp,包含1658 bp的ORF,编码552个氨基酸,在氨基酸序列上与芝麻、茸毛烟草和葡萄的同源性为54%,实时荧光定量结果表明,JsGDS在茉莉花活体花朵开放过程中,其表达量在22:00时最高,是未开放时期花朵(18:00)的9倍,随后略有下降但仍高于未开放时期;在花朵离体养护过程中,JsGDS的表达量在离体4h时达到最高,是未开放时期的8倍,随后下降。(3)JsTPS的cDNA全长为1884bp,包含1491bp的ORF,编码552个氨基酸,在氨基酸序列上与桂花、油橄榄、番茄、马铃薯和葡萄的同源性分别为78%、75%、51%、52%和49%,实时荧光定量结果表明,JsTPS在茉莉活体花朵开放过程中,其表达量在未开放(18:00)时最低,而后维持在高水平,22:00时达到最高,是未开放时期的75倍,而后下降;在离体花朵养护过程中,JsTPS的表达量随着离体时间的延长呈快速上升趋势,在离体8h时达到最高,是离体0h时的19倍,之后虽略有下降。(4)JsBEBT基因的cDNA全长1924 bp,包含1404 bp的ORF,编码467个氨基酸,在氨基酸序列上与荷花、甜瓜和野生番茄的同源性均高于72%,实时荧光定量结果表明,JsBEBT在茉莉活体花朵开放过程中,其表达量在未开放时最低,到20:00时表达量达到最高,是未开放花朵的35倍,之后呈下调趋势,但仍维持在较高水平;在离体养护过程中,JsBEBT的表达量随着离体时间的延长呈急剧上升,在离体4h时,就达到最高,是离体0h的2.8倍,之后下调。