miRNA-7-5p靶向调控RAF1/MEK/ERK信号转导通路影响胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的研究

来源 :锦州医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:tingyuanzhu
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目的研究miR-7-5p基因对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移的影响,并进一步探讨miR-7-5p在胃癌中的作用与RAF1/MEK/ERK通路有关,从而进一步阐明胃癌的发病机制、并为胃癌的治疗提供新的理论依据。方法(1)利用NCBI-pubmed、Targetscan、Star Base和miRBase等数据库和生物信息学技术找到相关的miRNAs,预测并从中筛选出它的靶基因。(2)实时定量PCR检测人胃癌SGC-7901细胞中miR-7-5p表达水平。(3)SGC-7901细胞分别转染miR-7-5p mimics、miR-7-5p mimics NC、miR-7-5p inhibitor、miR-7-5p inhibitor NC,应用Real-time PCR法检测miR-7-5p转染是否成功、对比24、36、48h转染效率选取最佳转染时间并检测靶基因RAF1表达情况。(4)应用MTT法检测不同条件下人胃癌细胞SGC-7901增殖活力。(5)Hoechst33258核染色实验观察不同条件下人胃癌细胞凋亡情况。(6)流式细胞术检测人胃癌细胞周期变化及凋亡情况。(7)细胞划痕实验检测不同条件下人胃癌细胞迁移情况。(8)Western-blot检测人胃癌细胞中RAF1、p-RAF1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9蛋白表达水平。结果一、miRNA及靶基因的筛选及验证1.通过NCBI-Pubmed数据库发现:胃癌组织及细胞中27个miRNA和66个基因存在于MAPK家族当中;Targetscan分析得出:其中四对miRNA与基因靶标关系及遗传保守性良好(Context++Score percentile≥80,PCT>0.4)。KEGG通路富集得出:RAF1作为miR-7-5p的靶基因通过MAPK-ERK信号转导通路影响胃癌的发生与发展。2.人胃癌细胞SGC-7901中miR-7-5p显著低表达(P<0.05),SGC-7901细胞转染miR-7-5p mimics后,miR-7-5p表达水平显著升高,其48h的转染效率为最高。3.分别用miR-7-5p mimics及RAF1 inhibitor处理细胞后,细胞中过表达miR-7-5p基因的RAF1表达水平明显下调(P<0.05),沉默的RAF1基因miR-7-5p表达水平明显上调(P<0.05),证明RAF1与miR-7-5p存在互靶关系。二.miR-7-5促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡1.过表达miR-7-5p的细胞,G0/G1期细胞百分率为75.94%,G2/M期细胞百分率为5.40%,细胞分裂进程较对照组比较明显减慢(P<0.05)。2.过表达miR-7-5p组细胞迁移速度减慢,而miR-7-5p沉默组迁移速度明显加快(P<0.05)。3.过表达miR-7-5p组细胞凋亡率明显增加,而沉默后的miR-7-5p组凋亡率明显降低(P<0.05)。4.过表达miR-7-5p组caspase3与caspase9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2/Bax、P-RAF1/RAF1比值明显降低(P<0.05),而miR-7-5p沉默组与之相反。三.miR-7-5p通过RAF1/MEK/ERK信号通路诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡1.miR-7-5p mimics及ERK抑制剂分别干预SGC-7901细胞24h后,细胞凋亡率为18.71%和27.3%,联合作用后凋亡率为30.7%,细胞凋亡明显加快,联合作用后效果为最强(P<0.05)。2.转染及给药24h后,细胞迁移速度减慢;miR-7-5p mimics与ERK抑制剂联合干预,细胞迁移速度最慢。3.转染及给药24h后,人胃癌SGC-7901细胞中caspase3、caspase9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2/Bax、P-RAF1/RAF1、P-MEK/MEK、P-ERK/ERK比值明显降低(P<0.05),以联合干预组作用最强。结论1.miR-7-5p在抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖及迁移方面发挥着十分重要的作用。2.过表达miR-7-5p与miR-7-5p沉默后,两种条件下的表现完全相反,说明胃癌中miR-7-5p可能通过靶向调控RAF1的表达发挥抑制细胞增殖和迁移的作用。3.miR-7-5p mimics与ERK抑制剂均可抑制胃癌细胞增殖及迁移作用,联合作用后作用最强,凋亡相关蛋白表达水平升高,负凋亡相关蛋白表达水平则降低;而miR-7-5p沉默后所有指标恰恰相反。说明miR-7-5p可能通过负向调节RAF1抑制MEK/ERK信号转导通路的激活,从而抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖及迁移。
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