目的:　　 通过对乳腺癌癌前病变细胞株MCF10AT及其裸鼠移植瘤模型进行中医药干预,从表观遗传学角度分析中医药对于抑癌基因ARHI和端粒酶逆转录酶hTTERT的甲基化状态以及DNA甲基化转移酶DNMT1、3a、3b的影响,并探索相关的信号通路,分析中医药对于癌前病变作用的机理所在,为治疗癌前病变提供理论及实验依据。　　 方法：　　 (1)复方仙蓉颗粒(CXRG)作用于人乳腺癌前病变细胞MCF10AT,MTT法检测细胞的增殖抑制情况,绘制细胞生长曲线。倒置显微镜观察细胞形态变化。阴性对照组只加细胞培养液,阳性对照组加5氮-2-脱氧胞苷(5-aza-cdr)。　　 (2)Real-time PCR法及Western blot法检测CXRG作用前后抑癌基因ARHI的表达;检测药物对hTERT及其抑制子E2F-1、激活子c-MYC表达的影响;观察药物作用前后3种主要的甲基化转移酶DNMT1、3a、3b的表达变化。　　 (3)Western blot法检测CXRG作用前后ARHI的后续信号Stat3的表达变化。　　 (4)甲基化特异性PCR法(MSP)检测CXRG作用前后ARHI基因启动子区的甲基化状态。　　 (5)将CXRG2.5mg/ml处理MCF10AT细胞接种于裸鼠,观察细胞的成瘤性、移植瘤的重量及体积,HE染色观察移植瘤的组织形态学情况;Western blot法检测移植瘤组织中ARHI、TERT及DNMT1的表达。空白组选用未经处理细胞接种,阳性对照组将5-arz-cdr15μmol/L处理的细胞接种裸鼠。　　 (6)将MCF10AT细胞直接接种裸鼠,模型组予生理盐水;CXRG组予CXRG水煎剂灌服,5-aza-cdr组予5-aza-cdr腹腔注射,观察移植瘤的重量及体积,HE染色观察移植瘤的组织形态学特点;Western blot法检测移植瘤的组织中ARHI、TERT、E2F-1、c-MYC、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达。　　 结果：　　 (1)药物干预48h,与未给药组相比,药物干预组对MCF10AT细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.01)。CXRG的抑制率随浓度的增加(2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、4mg/ml)而上升,分别为33.88％、44.91％、51.99％、71.05％,而5-aza-cdr组的抑制率随浓度的增加(10μmnol/L、12μmol/L、15μmol/L、20μmol/L)也呈上升趋势,分别为26.56％、35.68％、45.05％、62.20％。　　 (2)Real-time PCR及Western blot检测结果显示,药物干预后,ARHI mRNA表达上调,TERT、C-MYC及DNMT1、DNMT3a mRNA和蛋白表达下降,5-aza-cdr组效果明显优于CXRG组(P＜0.01);ARHI蛋白表达上调,E2F1 mRNA和蛋白表达上调,CXRG组与5-aza-cdr组效果无统计学差异(P＞0.05)。DNMT3b在5-aza-cdr组出现明显下调(P＜0.01),而CXRG组无明显变化(P＞0.05)。　　 (3)Western blot检测结果显示,药物干预后,CXRG组与5-aza-cdr组细胞Stag表达下调,且两组效果无统计学差异(P＞0.05)。　　 (4)MSP结果显示,未经药物处理的MCF10AT细胞,其ARHI基因启动子区域显示高甲基化状态;经CXRG处理的MCF10AT细胞,其ARHI基因甲基化和非甲基化引物均扩增出产物;5-aza-cdr处理组细胞出现完全去甲基化。　　 (5)将药物干预后的细胞接种裸鼠,各组裸鼠均成瘤。其中CXRG及5-aza-cdr处理的MCF10AT细胞接种裸鼠8周后,裸鼠瘤重及体积均明显小于空白组(P＜0.05)。将裸鼠移植瘤进行局部解剖观察发现,空白组裸鼠移植瘤呈分叶状,局部血管丰富清晰可见;CXRG组移植瘤表面光滑,活动度良好;5-aza-edr组移植瘤体积最小,形状扁平。　　 细胞接种8周后,空白组裸鼠移植瘤以浸润癌(IC)占4/8,不典型导管增生(ADH)占3/8,平坦型上皮不典型增生(FEA)占1/8。CXRG处理组裸鼠移植瘤ADH及普通导管增生(UDH)各占3/8,IC及FEA各占1/8。5-aza-cdr处理组裸鼠移植瘤以UDH占3/8,FEA及ADH各占2/8,IC为1/8。　　 Western blot检测结果显示,与空白组相比,CXRG处理组与5-aza-cdr处理组裸鼠移植瘤组织ARHI表达上调,TERT和DNMT1均有下调,且CXRG处理组与5-aza-cdr处理组相比无统计学差异(P＞0.05)。　　 (6)将MCF10AT细胞直接接种裸鼠,CXRG灌服8周后,其裸鼠瘤重及瘤体积均小于PBS组,但差异不显著(P＞0.05);5-aza-cdr腹腔注射裸鼠瘤重及瘤体积明显小于PBS组(P＜0.05)。　　 细胞接种8周后,灌服PBS组裸鼠移植瘤ADH和IC各为3/8,UDH和FEA分别为1/8。灌服CXRG组裸鼠移植瘤ADH为3/8,IC、FEA各为2/8,UDH为1/8。注射5-aza-cdr组裸鼠移植瘤以UDH占4/8,IC占2/8,FEA及ADH各为1/8。　　 Western blot检测结果显示,灌服CXRG组与注射5-aza-cdr组细胞ARHI表达上调,TERT、C-MYC及DNMT1表达下降,5-aza-cdr组效果明显优于CXRG组(P＜0.01)。5-aza-cdr组E2F1出现明显上调,DNMT3a、DNMT3b明显下调,而在CXRG组无明显变化(P＞0.05)。　　 结论：　　 (1)CXRG能够抑制乳腺癌癌前病变细胞MCF10AT的生长。其发挥作用的可能机制为:能够通过上调抑制子E2F1、下调激活子c-MYC从而使hTERT表达下降;可以降低甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a水平;能够改变ARHI基因甲基化状态,逆转抑癌基因ARHI基因和蛋白的表达。STAT3信号传导可能是后续的一条重要的通路。　　 (2)CXRG有抑制MCF10AT裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长的趋势,减少裸鼠移植瘤浸润癌的发生,可能是通过逆转抑癌基因ARHI的表达,降低TERT、c-MYC、DNMT1水平发挥作用。　　 (3)除以上机制外,CXRG可能还有其它作用途径,这将有待于进一步研究探讨。