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研究背景及目的:急性髓细胞白血病是造血干细胞恶性克隆性疾病,骨髓中白血病细胞大量增殖,抑制正常造血,导致患者中性粒细胞减少、贫血、血小板减少。如果不进行治疗,患者将在数周内死于出血和感染。目前对于急性髓细胞白血病的治疗,仍然以化疗为主,但因大多数化疗药物选择性差,毒副作用大,对正常机体免疫与造血系统有较大的损害,因此长期大剂量使用受到限制。所以寻找毒副作用小和选择性高的药物是提高临床疗效的重要途径。大蒜素为百合科植物大蒜(allium sativum)鳞茎中所含的一种抗癌活性成分,化学名称为二烯丙基三硫化物(DADS)。研究表明,大蒜素对肝癌、胃癌、乳腺癌、白血病等肿瘤均有抑制作用。其主要通过抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡,影响细胞周期,降低肿瘤易感性等发挥抗肿瘤效应。但对于血液肿瘤的研究国内外报道较少。尚未见大蒜素对急性单核细胞白血病的相关研究报道。本实验拟○1观察大蒜素对体外培养的人急性单核细胞白血病细胞THP-1的形态学、细胞周期的影响,探讨大蒜素是否对THP-1细胞具有增殖抑制作用;○2观察大蒜素对THP-1细胞凋亡的影响。○3观察大蒜素作用THP-1细胞后P-p38MAPK信号转导通路和凋亡基因蛋白Fas、FasL表达的变化,初步探讨大蒜素诱导THP-1凋亡的相关机制。方法:1.采用倒置显微镜观察THP-1细胞形态;2.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测大蒜素对THP-1细胞增殖抑制率;3.流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率和细胞周期分布;4.AO/EB染色观察细胞凋亡形态变化。5. Annexin V- FITC/PI双染法检测大蒜素作用后THP-1细胞早期凋亡。6.免疫细胞化学法观察大蒜素处理后细胞内磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)、Fas和FasL蛋白表达及分布变化。7.Western blot检测大蒜素处理前后细胞内P-p38MAPK、Fas和FasL蛋白表达量的变化。结果:1.MTT显示大蒜素能抑制THP-1细胞增殖,并呈时间–剂量依赖性。72h中效浓度(IC50)为12.8μg/mL? FCM检测大蒜素作用THP-1细胞72h后,G0/G1期细胞比率明显上升,而S期比率明显下降。6.4μg/mL,12.8μg/mL大蒜素作用THP-1细胞72h后均出现凋亡峰,凋亡率分别为(22.93±2.93)%和(36.73±2.88)%,呈剂量依赖性,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。2.大蒜素作用THP-1细胞后,经AO/EB染色,在荧光显微镜下观察,可出现明显的凋亡细胞。早期凋亡细胞,核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞,核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。随着大蒜素浓度的增加可见凋亡细胞增多,且以晚期凋亡细胞增多为主,呈剂量依赖性。3. Annexin V- FITC/PI双染法显示大蒜素(6.4μg/mL,12.8μg/mL)作用THP-1细胞72h后细胞凋亡率分别为(27.8267±1.1667)%和(45.283 3±1.3372)%,呈剂量依赖性,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。4.免疫细胞化学法检测药物处理后P-p38MAPK表达增加,主要分布于细胞核与细胞浆,而阴性对照组仅弱表达。Fas、FasL蛋白上调,主要分布在细胞浆和细胞膜。5. Western blot法显示P-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表达量随大蒜素浓度的增加而增加,呈剂量依赖性。其阴性组、72h的1/2IC50组、IC50组P-p38MAPK蛋白表达水平(相对灰度值)分别为0.2598±0.0132,0.3612±0.0083和0.5056±0.0055;Fas蛋白表达水平分别0.2874±0.0089, 0.4268±0.0079和0.5971±0.0109 ; FasL蛋白表达水平分别为0.2124±0.0141,0.2988±0.0280和0.4087±0.0266;差别均有显著性意义( P <0.01)。结论:1.大蒜素对THP-1细胞生长具有明显的增殖抑制作用,呈时间–剂量依赖性。2.大蒜素能影响THP-1细胞周期,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。3.大蒜素诱导THP-1细胞凋亡机制之一可能是通过激活P-p38MAPK/Fas/FasL途径?