目的构建pEGFP-N1-APOE ε2质粒,并将无毒pEGFP-N1-APOEε2注入Spague-Dawley(SD)小鼠侧脑室内,观察不同时间点SD小鼠脑部ApoeE2蛋白的表达情况。从动物实验角度探讨pEGFP-N1-APOE ε 2质粒是否可以进入活体动物脑部组织,并成功表达ApoeE2蛋白,并且记录ApoE2蛋白的表达时间及趋势,从而为AD的发病机制与基因治疗在基础研究方面提供实验依据。方法将ApoEε3基因中的第526bp的碱基C突变为T,3’端去TGA终止子(以ATG为起始),克隆至pEGFP-N1载体中,构建pEGFP-N1-ApoE ε2质粒,并提取pEGFP-N1-ApoE ε 2及pEGFP-N1无内毒素质粒。将pEGFP-N1-ApoE ε 2质粒、pEGFP-N1质粒分别和EntransterTM-in vivo体内转染试剂的溶液按比例混合。选用健康雄性SD小鼠共84只,3月龄左右,体重30～35克,按照随机化原理应用《随机数字表》进行分组,A组为实验组,B组为对照组。各组按侧脑室穿刺后设立第24H,48H,72H,5天、7天、10天、14天为实验动物观察点。分别进行:(1)对重建的pEGFP-N1-ApoE c2质粒进行检测,对插入部分进行测序,证实pEGFP-N1-ApoE ε2质粒的方向及序列是否正确,阅读框是否正确无误。并将质粒进行琼脂糖凝胶电泳,查看质粒DNA的大小。(2)根据不同时间点取脑组织,应用荧光显微镜对组织切片进行荧光观察。观察部位为侧脑室周围。(3)免疫组织化学法测定ApoE2蛋白的表达。应用免疫组化的实验方法,将脑组织进行染色,每张切片在40×10倍光镜下,在侧脑室周围区域进行观察,随机选取阳性区域内5个不重叠视野,显微镜下观察并计数阳性细胞,应用多功能真彩色细胞图象分析管理系统计数ApoE2免疫反应阳性细胞数量分级分数,取均值作为各时间点阳性表达细胞数量分级分数。(4)western blot方法测定ApoE2蛋白。结果1、pEGFP-N1-ApoE ε2质粒的检测对所购的ApoEε3基因,采用定点突变技术获得pEGFP-N1-ApoE ε 2质粒,并pEGFP-N1-ApoE ε 2质粒和pEGFP-N1质粒进行琼脂糖凝胶电泳结果。pEGFP-N1载体本身大小为4.7kb,将ApoEε2基因克隆到pEGFP-N1载体上得到的pEGFP-N1-ApoE ε2质粒大小约为5.7kb。将得到的pEGFP-N1-ApoE ε2质粒对插入部分进行测序,证实pEGFP-N1-ApoE ε2质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误。以上结果表明定点突变正确,重组pEGFP-N1-ApoE ε 2质粒构建成功。2、将pEGFP-N1-ApoE ε2质粒和pEGFP-N1质粒分别注射到各组小鼠侧脑室进行体内转染后,第一个24小时内所取材的脑组织中,应用荧光显微镜观察,实验组和对照组都能在小鼠侧脑室周围检测到绿色荧光蛋白的表达。3、相同时间点实验组较对照组ApoE2阳性表达明显增加,实验组的ApoE2阳性表达细胞数随时间延长有所增加,但对照组阳性表达细胞数无明显增加。将ApoE2免疫组化染色A、B阳性细胞数分级分数,同一时间数据点进行比较,差异有显着性统计学意义(P<0.01)。A、B两组同一时间点的阳性细胞的免疫组化评分差异有显着性统计学意义(P<0.01)。将A组内第1个24H的标本所得的免疫组化阳性细胞数分级分数和免疫组化评分结果与第72H、第5天、第7天、第10天、第14天比较,均存在显着性差异。4、Western blot检测结果表明,仅pEGFP-N1-ApoE ε 2质粒转染组有ApoE2蛋白表达,而对照组无ApoE2表达。结论1、通过对ApoE3基因的片段进行定点突变,获得了较为少见的人源ApoE2基因片段,并将此基因片段连接到pEGFP-NI载体上,构建重组的pEGFP-N1-ApoE ε2质粒。2、重组的pEGFP-N1-ApoE ε 2质粒应用EntransterTM-in vivo体内转染试剂,通过侧脑室注射的方法可以进入脑组织,并能够使目的蛋白得到表达;随时间延长,表达的蛋白量有所增加。