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背景:由Starzl等进行的肝移植的成功,为肝衰竭由终末期疾病转变为可长期有效生存带来希望,同时也造成了器官供应无法满足肝移植要求的新困境。因此急需更好的器官保护策略方法,以通过使用边缘移植物来满足不断增长的器官需求。材料与方法:250-300g雄性SD大鼠及血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)-1杂合子(HO-1+/-)和野生型(HO-1+/+)的大鼠用于本研究。本研究对远端缺血效应(remote ischemic conditioning,RIC)与传统的缺血后适应(ischemic postconditioning,IPostC)进行比较、对机器灌注(machine perfusion,MP)的流速、温度、氧合参数进行优化,并在此基础上研究MP与肝脏增生的相关性,以找到减少肝移植供肝损伤的最佳策略。结果:远端缺血间效应(remote ischemic preconditioning,RIPerC)通过抑制氧化应激和上调 PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)/一氧化氮(nitricoxide,NO)通路,对肝移植缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤起到保护作用,而且这种保护作用效果与IPostC相似抑或更好;50%门静脉生理流速相比于150%生理流速减少剪切力损伤且避免了 12.5%生理流速灌注不足问题;在灌流液不携氧的前提下,低温保存效果优于亚常温及常温机器灌注(subnormothermic and normothermic machine perfusion,SMP and NMP);灌流液中额外补充携氧可以进一步改善供肝保存效果。有关低温机器灌注(hypothermic machine perfusion,HMP)机制研究表明,HO-1低表达通过抑制增殖而不是细胞凋亡来降低HMP诱导的肝功能恢复,至少部分原因是下调肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)-Akt 轴而不是白介素(interleukin,IL)-6 和转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路。结论:RIC是减轻肝移植I/R损伤理想的干预方式;MP供肝保存优于SCS,保护机制与促进肝脏再生相关;低温携氧灌注仍是相对简单有效的方法,门静脉流速以50%生理流速为佳,仍需进一步研发理想携氧灌流液。第一部分 远端缺血间效应可预防大鼠肝脏移植后缺血/再灌注损伤:ROS/RNS和eNOS的作用研究背景:我们以前的研究成功建立了大鼠肝移植RIC的新型模型,并已证明其对I/R损伤的保护作用。本文我们将进一步研究其潜在的机制。材料方法:随机将Sprague-Dawley大鼠分为4组:假手术组,原位标准肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)组,IPostC 组和 RIPerC 组。再灌注 3h 后,取血样用于测定 ALT,AST,肌酐(creatinine,Cr)和肌酸激酶同工酶(creatinine kinase-myocardial band,CK-MB)。取肝叶组织分别使用 ROS/过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2),JC-1和总NOx测定试剂盒用于以下指标测量:ROS,H202,线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)和总NOx。这些测量分别使用通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法分析eNOS含量,并通过蛋白质印迹法测定三硝基酪氨酸半定量过氧亚硝酸盐。结果:与OLT组相比,RIPerC组肝脏移植物和远隔器官功能明显改善(P<0.05)。与假手术组相比,OLT组的ROS(P<0.001)包括H2O2(P<0.05)明显升高,RIPerC(P<0.05)逆转了这一趋势。OLT组I/R损伤引起的ΔΨm的降低在RIPerC组中明显减弱(P<0.001)。与OLT组相比,RIPerC组肝脏移植物中NO和磷酸丝氨酸eNOS的蛋白质和mRNA水平的均明显增加(P<0.05)。与OLT组相比,RIPerC组I/R诱导的3-硝基酪氨酸含量显着降低(P<0.05)。除了 Cr之外,RIPerC和IPostC组之间的所有结果没有显着差异。RIPerC组的Cr水平低于IPostC组(P<0.01)。结论:RIPerC通过抑制氧化应激和上调PI3K/Akt/eNOS/NO通路,对肝移植I/R损伤起到保护作用,而且这种保护作用效果与IPostC相似抑或更好。第二部分 优化离体供肝机器灌注的关键参数背景:肝移植被认为是终末肝衰竭患者治疗的黄金标准。许多研究表明MP优于SCS,特别是随着ECD以及DCD等边缘供肝的使用越来越多后研究更加深入。但是,对MP的关键参数如流速、温度和氧合没有共识。方法:实验基于我们以前研发的机器灌注系统进行。根据不同速度,分为6组:静态冷保存组,12.5%流速组,25%流速组,50%流速组,100%流速组和150%流速组;根据不同温度,分3组:0-4℃组,20℃组,37℃组;根据是否加氧,分为两组:空气组和95%O2+5%CO2组,灌注离体供肝6-24h后,收集灌注液用于肝功能检测,收集肝组织用于HE染色,及髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)检测,同时监测门静脉压力和速度。结果:50%门静脉生理流速相比于150%生理流速减少剪切力损伤且避免了 12.5%生理流速灌注不足问题;在灌流液不携氧的前提下,低温保存效果优于常温及亚常温;灌流液中额外补充携氧可以进一步改善供肝保存效果,UW与HTK液携氧效果仍不理想。结论:低温携氧灌注仍是相对简单有效的方法,门静脉流速以50%生理流速为佳。第三部分 HO-1的低表达抑制HMP诱导的肝增生从而减弱了对大鼠肝损伤保护作用背景:我们前期研究发现与SCS相比,HMP能够通过促进肝脏增生起到保护肝脏移植物的作用,但具体的机制不清楚。据报道,HO-1在促进肝细胞增殖中起关键作用。在此我们研究了 HO-1 在 HMP 对半肝移植(half-size liver transplantation,HSLT)移植物保护中的作用。方法和材料:本实验用HO-1(HO-1+/-)杂合子和野生型(HO-1+/+)的大鼠,进行体内(减体积供肝在体外进行3h SCS或HMP后移入体内和体外试验(供肝在体外进行6h SCS或HMP)。体外组0,1,3和6 h和体内组HSLT后1,3和7d,收集灌注液和血浆样品用于肝功能分析。体外保存6h,体内HSLT7d后获得肝脏用于确定再生率(regeneration ratio,RR),并将部分肝组织于10%中性福尔马林中固定,用于组织学和免疫组织化学分析。结果:我们发现HSLT诱导再生肝中HO-1蛋白水平显著升高,HO-1单倍体缺失导致HSLT后增殖减少。HMP诱导HO-1蛋白水平显著升高,且体内外实验肝功能恢复优于SCS,HO-1单倍体缺失则抑制了这种趋势。HO-1单倍体诱导的增殖减少,而不是细胞凋亡导致体内外实验中HMP再生能力的减弱。这种现象可能是由于抑制HO-1表达导致HGF/Akt通路活性的降低所致。结论:我们的研究结果表明,HO-1低表达通过抑制增殖而不是细胞凋亡来降低HMP诱导的HSLT肝功能恢复,至少部分原因是下调HGF/Akt轴而不是IL-6和TGF-β信号通路。