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目的: 探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对高糖培养的人视网膜血管内皮细胞(HREC)的增殖以及IL-8、IL-10表达的影响。 方法: 1:取完全培养基中HREC加入96孔板内,每孔约4000个细胞,待细胞贴壁,饥饿处理24小时后,加入高糖培养基(30mM葡萄糖)分别培育12、24、36、48小时后,每孔加入CCK-8试剂20ul,37℃恒温培养箱放置2-4小时,酶联仪检测每孔内450nm波长的吸光度(OD值),记录并分析。 2:取完全培养基中HREC加入96孔板内,每孔约4000个细胞,待细胞贴壁,饥饿处理24小时后,分别加入(1)实验组含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖条件上清完全培养基。(含有hUCMSCs的上清液),(2)对照组含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖完全培养基。其余孔中分别加入无细胞只含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖完全培养基以及无细胞只含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖条件上清完全培养基(含有hUCMSCs的上清液),分别培育12、24、36、48小时后,每孔加入CCK-8试剂20ul,37℃培养箱放置2-4小时,酶联仪检测每孔内450nm波长的吸光度(OD值),记录并分析。 3:我们采用间接共培养Transwell复合培养体系将hUCMSCs加入Transwell系统的上层小室,下室中加入含有30mmol/L葡萄糖及HREC;将hUCMSCs按照1∶1的比例与HREC共培养。实验分为对照组(完全培养基),高糖组,hUCMSCs与HREC共培养正常组以及hUCMSCs与HREC共培养高糖组进行,ELISA检测各组细胞培养上清液中白细胞介素(IL)-8、白细胞介素(IL)-10的浓度。 4:将HREC分为三组,分别加入正常对照组(N)细胞培养液含5.5mmol/L葡萄糖、30mmol/L葡萄糖以及30mmol/L甘露醇的培养基,分别干预12、24、36、48小时后提取细胞RNA,检测高糖对HREC中IL-8、IL-10的RNA表达影响。 5:我们采用间接共培养Transwell复合培养体系将hUCMSCs加入Transwell系统的上层小室,下室中加入含有30mmol/L葡萄糖及HREC;将hUCMSCs按照1∶1的比例与HREC共培养。实验分为对照组(完全培养基),高糖组,hUCMSCs与HREC共培养正常组以及hUCMSCs与HREC共培养高糖组进行。采用RT-PCR法分别检测对照组、高糖组、共培养正常组、共培养高糖组HREC的IL-8、IL-10mRNA表达水平。 结果: 1:CCK-8结果显示: 36小时和48小时,高糖组与高糖hUCMSCs组细胞存活率相比,差异具有统计学意义(P<0.05),结果说明用高糖hUCMSCs的条件上清培养基促进HREC的增殖(与高糖对照组相比)。 2:ELISA检测结果显示: (1)高糖刺激下,高糖组培养上清中IL-8水平较对照组明显降低,且随着时间的推移,上清液中IL-8的表达量呈逐渐升高的趋势;与此同时,在12h和24h,与对照组相比,共培养正常组、共培养高糖组IL-8表达水平降低,两者差异具有统计学意义(P=0.000,P<0.01); 高糖刺激下,共培养高糖组培养上清中IL-8的水平较高糖组明显降低,差异具有统计学意义(P=0.000)。且四组细胞上清液中IL-8的浓度与时间呈正相关。 (2)高糖刺激下,高糖组培养上清中IL-10水平较对照组明显降低,且随着时间的推移,上清液中IL-10的表达量呈逐渐升高的趋势;与此同时,在12h和24h,与共培养正常组相比,共培养高糖组IL-10表达水平降低,两者差异具有统计学意义(P<0.05);高糖刺激下,共培养高糖组培养上清中IL-10的水平较高糖组明显升高,且IL-10的表达量与时间呈正相关。两者差异具有统计学意义。(P=0.000) 3:PCR结果显示: (1)高糖刺激HREC下,IL-8mRNA表达量明显增加,均高于正常组和甘露醇组(P<0.05),在各个时间点内,高糖组IL-8mRNA表达量均明显高于对照组、甘露醇组、共培养正常组、共培养高糖组;与高糖组和对照组相比,共培养高糖组IL-8mRNA表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (2)高糖刺激HREC下,IL-10mRNA表达量明显降低,均低于正常组和甘露醇组(P<0.05),在36h和48h时间点下,与高糖组相比,共培养高糖组IL-10mRNA明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),随着时间的推移,高糖组IL-10mRNA表达量呈逐渐递减的趋势。(P<0.05) 结论: 1:hUCMSC能提高被高糖抑制的人视网膜血管内皮细胞增生活力。 2:hUCMSCs能够抑制高糖下HREC的炎症因子IL-8的表达,同时增加抑炎因子IL-10的表达。