人脐带间充质干细胞对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞的免疫调节作用

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目的:  探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对高糖培养的人视网膜血管内皮细胞(HREC)的增殖以及IL-8、IL-10表达的影响。  方法:  1:取完全培养基中HREC加入96孔板内,每孔约4000个细胞,待细胞贴壁,饥饿处理24小时后,加入高糖培养基(30mM葡萄糖)分别培育12、24、36、48小时后,每孔加入CCK-8试剂20ul,37℃恒温培养箱放置2-4小时,酶联仪检测每孔内450nm波长的吸光度(OD值),记录并分析。  2:取完全培养基中HREC加入96孔板内,每孔约4000个细胞,待细胞贴壁,饥饿处理24小时后,分别加入(1)实验组含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖条件上清完全培养基。(含有hUCMSCs的上清液),(2)对照组含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖完全培养基。其余孔中分别加入无细胞只含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖完全培养基以及无细胞只含有DMEM/30mmol/LD-葡萄糖条件上清完全培养基(含有hUCMSCs的上清液),分别培育12、24、36、48小时后,每孔加入CCK-8试剂20ul,37℃培养箱放置2-4小时,酶联仪检测每孔内450nm波长的吸光度(OD值),记录并分析。  3:我们采用间接共培养Transwell复合培养体系将hUCMSCs加入Transwell系统的上层小室,下室中加入含有30mmol/L葡萄糖及HREC;将hUCMSCs按照1∶1的比例与HREC共培养。实验分为对照组(完全培养基),高糖组,hUCMSCs与HREC共培养正常组以及hUCMSCs与HREC共培养高糖组进行,ELISA检测各组细胞培养上清液中白细胞介素(IL)-8、白细胞介素(IL)-10的浓度。  4:将HREC分为三组,分别加入正常对照组(N)细胞培养液含5.5mmol/L葡萄糖、30mmol/L葡萄糖以及30mmol/L甘露醇的培养基,分别干预12、24、36、48小时后提取细胞RNA,检测高糖对HREC中IL-8、IL-10的RNA表达影响。  5:我们采用间接共培养Transwell复合培养体系将hUCMSCs加入Transwell系统的上层小室,下室中加入含有30mmol/L葡萄糖及HREC;将hUCMSCs按照1∶1的比例与HREC共培养。实验分为对照组(完全培养基),高糖组,hUCMSCs与HREC共培养正常组以及hUCMSCs与HREC共培养高糖组进行。采用RT-PCR法分别检测对照组、高糖组、共培养正常组、共培养高糖组HREC的IL-8、IL-10mRNA表达水平。  结果:  1:CCK-8结果显示:  36小时和48小时,高糖组与高糖hUCMSCs组细胞存活率相比,差异具有统计学意义(P<0.05),结果说明用高糖hUCMSCs的条件上清培养基促进HREC的增殖(与高糖对照组相比)。  2:ELISA检测结果显示:  (1)高糖刺激下,高糖组培养上清中IL-8水平较对照组明显降低,且随着时间的推移,上清液中IL-8的表达量呈逐渐升高的趋势;与此同时,在12h和24h,与对照组相比,共培养正常组、共培养高糖组IL-8表达水平降低,两者差异具有统计学意义(P=0.000,P<0.01);  高糖刺激下,共培养高糖组培养上清中IL-8的水平较高糖组明显降低,差异具有统计学意义(P=0.000)。且四组细胞上清液中IL-8的浓度与时间呈正相关。  (2)高糖刺激下,高糖组培养上清中IL-10水平较对照组明显降低,且随着时间的推移,上清液中IL-10的表达量呈逐渐升高的趋势;与此同时,在12h和24h,与共培养正常组相比,共培养高糖组IL-10表达水平降低,两者差异具有统计学意义(P<0.05);高糖刺激下,共培养高糖组培养上清中IL-10的水平较高糖组明显升高,且IL-10的表达量与时间呈正相关。两者差异具有统计学意义。(P=0.000)  3:PCR结果显示:  (1)高糖刺激HREC下,IL-8mRNA表达量明显增加,均高于正常组和甘露醇组(P<0.05),在各个时间点内,高糖组IL-8mRNA表达量均明显高于对照组、甘露醇组、共培养正常组、共培养高糖组;与高糖组和对照组相比,共培养高糖组IL-8mRNA表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。  (2)高糖刺激HREC下,IL-10mRNA表达量明显降低,均低于正常组和甘露醇组(P<0.05),在36h和48h时间点下,与高糖组相比,共培养高糖组IL-10mRNA明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),随着时间的推移,高糖组IL-10mRNA表达量呈逐渐递减的趋势。(P<0.05)  结论:  1:hUCMSC能提高被高糖抑制的人视网膜血管内皮细胞增生活力。  2:hUCMSCs能够抑制高糖下HREC的炎症因子IL-8的表达,同时增加抑炎因子IL-10的表达。
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