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目的:通过对香烟暴露生物标志物的测定,探讨香烟在体内的内暴露水平;从分子生物学层面验证吸烟对雄性大鼠生殖系统的毒性作用;探讨表观遗传调控在吸烟所致雄性生殖毒性中的机制。方法:SD大鼠240只(雄性160只,雌性80只),随机分为2、4、6、8、12周的低、中、高染毒剂量组及空白对照组。香烟暴露组按不同染毒剂量进行呼吸道静式染毒,每日一次;空白对照组未进行香烟暴露处理。于不同时间点分别处死吸烟组和对照组大鼠,进行指标测定。香烟暴露组雄鼠于处死前1周分别与雌鼠(未染毒)按1∶1合笼交配,怀孕雌鼠自然分娩后连续观察仔鼠生长发育情况21天后实验结束。GC-MS/MS定量分析血浆中尼古丁、可替宁含量;HE染色观察睾丸组织的结构形态;TUNEL法测定睾丸细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测各组大鼠睾丸Caspase-3活性;RT-PCR及Western Blot法测定线粒体凋亡通路中相关基因:Apaf-1、caspase-9、Bim、Bcl-w、Bak、及Ube2B的mRNA和蛋白的表达;计算各组大鼠的子代出生数及仔鼠的存活率和死亡率;测定大鼠睾丸组织中组蛋白乙酰化酶及组蛋白去乙酰化酶的活性;运用mi RNA高通量芯片测序技术筛选香烟烟雾暴露后雄性大鼠睾丸组织miRNAs表达谱的改变情况,并对其靶基因进行预测。结果:(1)香烟暴露组大鼠出现张口喘息、流涎,腹式呼吸加剧,鼻噪音等症状;且染毒剂量越高,染毒周期越长,体重减少越明显(P<0.05);(2)不同暴露时间及暴露剂量间尼古丁含量的变化无统计学差异,且暴露时间与暴露剂量间无交互效应(P>0.05);(3)随暴露时间的延长,暴露剂量的增加,大鼠血浆中可替宁含量较空白对照组(340±41.97 ng/ml)有所增加,不同暴露周期间可替宁含量的差异存在统计学差异(P<0.05),且暴露时间与暴露剂量存在交互效应(P<0.05);(4)香烟暴露组大鼠随染毒时间及剂量的增加,睾丸组织病理学改变也愈加明显。12周起大鼠睾丸组织出现明显的萎缩,大量细胞裂解,甚至在高剂量组中可见各级生精细胞完全消失,曲细精管空虚成网格状分布。(5)随暴露周期的延长,染毒组大鼠睾丸组织中逐渐出现TUNEL阳性染色,且12周组染色最为强烈;(6)香烟暴露组大鼠睾丸组织胞浆中含有caspase-3阳性细胞,阳性蛋白浓度于染毒第2周起逐渐增加(P<0.05),染毒第6周起Caspase-3的蛋白表达总量显著升高(p<0.01);(7)香烟暴露组大鼠睾丸apaf-1基因的mrna和蛋白表达上调,且不同暴露周期间apaf-1基因的mrna表达的差异有统计学意义(p<0.01);与空白对照组相比,12周中、高剂量染毒组apaf-1基因mrna和蛋白表达的上调有显著性差异(p<0.05);(8)香烟暴露组大鼠睾丸capase-9基因的mrna和蛋白表达上调,且不同暴露周期间capase-9基因mrna和蛋白表达的差异有统计学意义(p<0.01);与空白对照组相比,12周中、高剂量染毒组capase-9基因mrna表达的上调有显著性差异(p<0.05),8周高剂量及12周中、高剂量染毒组睾丸capase-9蛋白表达的上调有统计学意义(p<0.05);(9)香烟暴露组大鼠睾丸bim基因的mrna和蛋白表达上调,且不同暴露周期间bim基因mrna表达的差异有统计学意义(p<0.01),与空白对照组相比,12周低剂量染毒组bim基因mrna表达的上调有显著性差异(p<0.01);(10)香烟暴露初期,大鼠睾丸bak基因的mrna表达下调,第8周起表达逐渐上调,而bak的蛋白表达持续上调,且不同暴露周期间bak蛋白表达的差异有统计学意义(p<0.01);与空白对照组相比,12周高剂量组睾丸bak蛋白表达的上调有统计学意义(p<0.05);(11)香烟暴露组大鼠睾丸bcl-w基因的mrna和蛋白表达下调,不同暴露周期间bcl-w蛋白表达的差异有统计学意义(p<0.01),且暴露时间与暴露剂量间存在交互效应(p<0.01);与空白对照组相比,6周、8周高剂量及12周各剂量组睾丸bcl-w蛋白表达的下调有统计学意义(p<0.05);(12)香烟暴露初期,大鼠睾丸ube2b基因的mrna表达上调,第8周起表达逐渐下调,而ube2b的蛋白表达持续下调,且不同暴露周期间ube2b蛋白表达的差异有统计学意义,与空白对照组相比,8周组中、高剂量染毒组和12周中、高剂量染毒组睾丸ube2b蛋白表达的下调呈现统计学差异(p<0.05);(13)雄性大鼠的子代出生数随香烟暴露时间及剂量的增加而减少,不同香烟暴露方式的仔鼠存活率有显著性差异(p<0.05);(14)香烟暴露组大鼠睾丸组蛋白乙酰化酶(hat)的活性升高,且不同暴露剂量间组蛋白乙酰化酶活性的差异有统计学意义(p<0.05);与空白对照组相比,8周高剂量、12周各剂量染毒组大鼠睾丸组蛋白乙酰化酶活性的增高有显著性差异(p<0.05);(15)香烟暴露组大鼠睾丸组蛋白去乙酰化酶(hdac)的活性降低,与空白对照组相比,6周高剂量以后各染毒组大鼠睾丸hdac活性的下降有统计学意义(p<0.05);(16)吸烟大鼠睾丸组织mirna芯片筛选出5个差异性表达的mirnas,其预测的靶基因主要参与细胞凋亡正调节的生物学过程且明显富集于细胞凋亡信号通路中。结论:大鼠血浆可替宁浓度能够有效反映香烟烟雾内暴露情况;香烟暴露可造成大鼠生殖系统损伤,其可能机制是吸烟激活了线粒体凋亡信号通路,从而导致睾丸组织不可逆性凋亡;吸烟可导致睾丸组织发生组蛋白乙酰化修饰及mirna特异性表达,提示表观遗传调控在吸烟所致大鼠生殖毒性损伤中起到重要作用。