研究背景:肝细胞癌(以下简称肝癌)是我国成人肝移植的主要适应症之一,如何降低肝移植受者肿瘤复发转移率至关重要。肌肉减少症是一种与年龄相关的骨骼肌肌量和功能下降的疾病,其发生与机体营养状况、运动量以及是否存在慢性疾病等多种因素相关。炎症细胞因子能够激活多种分子途径参与骨骼肌消耗,造成肌肉蛋白质合成和分解代谢的失衡,从而导致肌肉减少症的发生。既往研究已表明肌肉减少症能影响肝癌等恶性肿瘤患者的预后。因此,开展肝癌肝移植受者术前肌肉减少症对肝移植受者预后影响的研究,筛选、确立敏感的炎症细胞因子并进行深入的机制研究,实现肝癌肝移植术后肿瘤复发的有效预警具有十分重要的临床意义。研究目的:旨在研究肝癌肝移植受者术前合并肌肉减少症对肝移植预后的影响;基于炎症相关蛋白质组学等技术筛选并确立肌肉减少症和肝癌肝移植术后肿瘤复发相关的炎症细胞因子;针对上述研究所确立的关键炎症细胞因子,开展肌肉减少症影响肝癌肝移植受者预后的潜在机制研究。研究方法:第一部分:本研究回顾性纳入了2012年1月1日至2017年12月31日期间因肝癌在本中心接受肝移植手术的病人136例。获取其临床资料与随访信息,勾画并测量了受者术前CT图像中第3腰椎水平骨骼肌的面积,将骨骼肌肌量(Skeletal muscles mass,SMI)<43.75 cm~2/m~2定义为肌肉减少症。应用Cox回归分析了有无肌肉减少症及其他临床病理因素对肝癌肝移植受者预后的影响,并根据多因素分析所获得的独立危险因素绘制列线图模型。基于Kaplan-Meier生存分析,明确肌肉减少症对肝癌肝移植受者总体生存期(Overall survival,OS)及无复发生存期(Recurrence-free survival,RFS)的影响。同时,对肝癌病人发生肌肉减少症的相关临床病理因素进行了分析。第二部分:应用Bio-Plex Pro?技术检测了136例肝癌肝移植受者术前血清中的38种炎症细胞因子水平,获得了基于这38种炎症细胞因子含量的炎症相关蛋白质组学数据。通过肌肉减少症与非肌肉减少症受者的对比分析,确立了与肌肉减少症发生相关的候选炎症细胞因子,并开展了炎症细胞因子之间的相关性研究。应用Cox回归分析以明确上述炎症细胞因子的表达水平与肝癌肝移植受者预后的相关性,通过设立各自的cut-off值,基于Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线,确定不同水平的炎症细胞因子对肝癌肝移植受者预后的影响。第三部分:上述研究发现炎症细胞因子CHI3L1与肝癌肝移植受者预后相关,利用质粒在小鼠肝癌细胞系Hep1-6及人肝癌细胞系Huh7中过表达chi3l1,探索CHI3L1蛋白对肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭的影响,并利用Western blot检测了肿瘤侵袭相关蛋白的表达改变。研究了成肌细胞C2C12在分化过程中的形态改变以及CHI3L1蛋白的表达量变化,探索了C2C12在过表达chi3l1后其增殖、凋亡情况的改变。将过表达chi3l1的C2C12与小鼠肝癌细胞系Hep1-6共培养,研究成肌细胞CHI3L1表达情况对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响。利用TNF-α或LPS作为炎症刺激条件,并通过小干扰RNA敲低了C2C12细胞中的chi3l1,再次将C2C12与Hep1-6共培养,研究肝癌细胞迁移、侵袭能力的改变。研究结果:第一部分:所纳入的136例肝癌肝移植受者中有29例在术前合并肌肉减少症,占比21.3%。在单因素Cox回归分析中,AFP>250 ng/ml(HR=1.708,p=0.042),超出杭州标准(HR=2.066,p=0.006),超出米兰标准(HR=2.057,p=0.015),PVTT(HR=2.206,p=0.003),合并肌肉减少症(HR=2.153,p=0.007)均与肝癌肝移植受者的OS相关。且其中的AFP水平(p=0.011)、存在PVTT(HR=2.014,95%CI=[1.182,3.433],p=0.010)、合并有肌肉减少症(HR=1.982,95%CI=[1.129,3.479],p=0.017)是肝癌肝移植受者预后不良的独立危险因素,并基于这3个因素构建了预测肝癌肝移植受者总体生存的列线图模型。利用Kaplan-Meier生存分析发现,术前合并肌肉减少症是肝癌肝移植受者OS及RFS的不利影响因素(p分别=0.007和0.041)。根据受者是否符合肝癌肝移植杭州标准,本研究又对肌肉减少症进行了亚组分析。超出杭州标准且合并有肌肉减少症的肝癌肝移植受者,其OS及RFS明显劣于其余3组。最后,研究发现受者术前的BMI水平与肌肉减少症的发生率负相关(21.2±2.0 vs.23.7±2.7,p<0.001),BMI指数越低的人群,发生肌肉减少症的风险相对越高。第二部分:利用炎症相关蛋白质组学的数据,我们发现CHI3L1、TNFSF13B和IL-19这3种炎症细胞因子的水平与肌肉减少症的发生相关,在肌肉减少症组及非肌肉减少症组中它们的含量分别为13271.64±3897.01 pg/ml和11400.77±3833.07 pg/ml(p=0.026),154013.92±75095.85 pg/ml和127301.49±62482.11pg/ml(p=0.026),97.03±33.57 pg/ml和81.10±38.95 pg/ml(p=0.033)。且CHI3L1与TNFSF13B含量之间存在弱相关性,相关系数r=0.37。以16500 pg/ml作为TNFSF13B含量的cut-off值,发现高TNFSF13B组受者的OS及RFS均劣于低TNFSF13B组(p均<0.001)。以13800 pg/ml作为CHI3L1含量的cut-off值,高CHI3L1组受者的OS(p=0.024)及RFS(p=0.020)均劣于低CHI3L1组。第三部分:在小鼠肝癌细胞系Hep1-6及人肝癌细胞系Huh7中过表达chi3l1可以上调肿瘤侵袭相关蛋白,促进肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力。成肌细胞C2C12在分化过程中,其CHI3L1表达量逐渐升高。过表达chi3l1可以提高成肌细胞C2C12的增殖能力,减少C2C12在LPS刺激下的细胞凋亡。过表达chi3l1的成肌细胞能够促进肝癌细胞上调侵袭相关蛋白,促进其迁移、侵袭能力。TNF-α或LPS引起的炎症刺激能够使C2C12细胞上调CHI3L1,使成肌相关蛋白表达升高。TNF-α预处理的C2C12能够促进肝癌细胞Hep1-6的迁移、侵袭能力,经过TNF-α预处理但敲低了chi3l1的C2C12促进肝癌细胞迁移、侵袭的能力明显变弱。研究结论:术前合并肌肉减少症会增加肝癌肝移植受者的肿瘤复发率,减少受者的总体生存时间,是肝癌肝移植受者预后不良的独立危险因素。炎症相关蛋白质组学研究发现,炎症细胞因子CHI3L1、TNFSF13B和IL-19可以作为肌肉减少症的生物标志物,受者术前血清中高水平的CHI3L1和TNFSF13B与肝癌肝移植受者预后不良相关,这两种炎症细胞因子有望成为肝癌肝移植受者预后不良的预警分子。炎症刺激下成肌细胞会上调CHI3L1,后者能促进成肌细胞本身的增殖、分化、抗凋亡能力,同时也能促进肝癌细胞的增殖、侵袭能力。