植物黑芥子酶(β-硫代葡萄糖苷酶)属于葡萄糖苷酶1(glucosidase hydrolyase 1,GH1)家族成员,其与硫代葡萄糖苷(glucosinolates,GS)共同组成了植物应对植食性昆虫取食的化学防御系统。在某些十字花科蔬菜害虫中,含有自身编码的黑芥子酶基因,形成了类似植物黑芥子酶-硫代葡萄糖苷的化学防御系统。小菜蛾(Plutella xylostella)为十字花科蔬菜上的重要害虫,具有代谢解毒GS的特殊途径,但是否也具有利用寄主化学防御系统的能力,仍不清楚。本论文基于小菜蛾基因组信息,搜寻鉴定黑芥子酶基因同源序列,筛选在幼虫中肠偏好表达且可能受植物源物质调控的候选基因,结合体内和体外的酶活测定,以揭示黑芥子酶基因同源序列在小菜蛾适应寄主植物过程中的功能和作用。1.小菜蛾黑芥子酶基因同源序列的鉴定与表达谱基于小菜蛾基因组信息,鉴定了 13个注释为黑芥子酶基因的同源序列。它们都具有GH1家族的保守结构域,通过构建系统发育树开展进化分析,发现小菜蛾黑芥子酶基因成员之间亲源性较低,与拟南芥的亲源较远,不存在基因水平转移现象;利用qRT-PCR对各成员在不同发育阶段的基因表达模式进行分析,发现存在2个幼虫阶段特异高表达基因,6个成虫阶段特异高表达基因,1个蛹期特异高表达基因,且雌性蛹高于雄性蛹,剩余4个基因的表达未呈现明显规律,且所有黑芥子酶基因在卵期的表达都十分微量;利用qRT-PCR对各成员在幼虫不同组织中的基因表达模式进行分析,发现存在5个中肠特异高表达基因,2个脂肪体特异高表达基因,2个马氏管特异高表达基因,剩余4个基因的表达未呈现明显规律。2.萝卜子叶和硫苷饲喂后小菜蛾的生物学参数和黑芥子酶表达为探究小菜蛾黑芥子酶基因在小菜蛾取食十字花科蔬菜过程中是否会受到寄主影响,本研究采用人工饲料品系(artificial diet,AD)小菜蛾进行了短期和长期转食萝卜子叶实验。小菜蛾4龄幼虫中肠组织的qRT-PCR结果表明,Px008848、Px009428、Px006054基因表达在食源改变后受到显著诱导,Px008848的表达量随着取食时间的增加而逐渐上升;通过制备Px008848基因对应蛋白的抗体开展Western blot,结果显示Px008848蛋白表达在食源改变后同样显著上调;生物学观测实验表明,转食萝卜子叶后与取食人工饲料相比,小菜蛾幼虫发育历期延长且蛹重降低。参照十字花科植物中GS的含量,配置不同GS浓度的人工饲料饲喂AD品系小菜蛾,发现AD品系小菜蛾取食不同GS浓度的饲料后,黑芥子酶基因的表达受到浓度和时间的交互影响,Px008848蛋白在含有高浓度GS饲料上的表达水平显著高于对照组。3.小菜蛾黑芥子酶活性通过提取福州敏感品系小菜蛾不同发育阶段、幼虫不同组织的活性蛋白与GS反应,借助气相色谱串联质谱(GC-MS)平台检测挥发性产物异硫氰酸酯(AITC)的生成,以验证小菜蛾黑芥子酶活性,实验结果显示,在小菜蛾不同发育阶段、幼虫不同组织与GS的反应中均未检测到AITC信号,表明小菜蛾体内不存在黑芥子酶活性,或者活性低于检测体系的灵敏度。4.Px008848基因的原核表达与活性针对候选基因Px008848进行蛋白原核表达,对原核表达的包涵体进行复性。GC-MS测定结果表明,复性后的Px008848蛋白不具有黑芥子酶活性,但β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性检测试剂盒的结果表明,Px008848蛋白具有潜在的β-GC活性。鉴于β-GC在水解植物纤维素和解毒代谢过程中有重要的作用,推测小菜蛾黑芥子酶可能参与了植物细胞壁的水解过程或者解毒代谢的过程。本文研究对小菜蛾中黑芥子酶基因同源序列开展了系统鉴定、基因/蛋白表达和活性检测,发现不同的昆虫中虽然均存在黑芥子酶基因同源序列,但却并不都具有黑芥子酶活性。然而,本研究同时还发现小菜蛾中黑芥子酶基因同源序列的表达受到植物源物质和GS所影响,这为后续深入研究昆虫中黑芥子酶基因同源序列的功能奠定了基础。