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研究背景:创伤致继发性心脏损伤（Trauma-induced secondary cardiac injury,TISCI）是指创伤患者无心脑血管等慢性病史,在入院24 h内常规辅助检查未检测到心功能障碍,但在创伤后数天或数月出现心脏疾患。由于其病情隐匿,极易漏诊,可能因错过最佳治疗时间导致患者死亡,因此对其发病机制的研究显得尤为重要。文献表明,导致创伤后继发性心脏损伤最主要的原因是心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡是由一系列半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases）级联反应所致,主要机制包括死亡受体通路、线粒体通路以及内质网通路,这三条通路分别通过激活Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12,最终引起Caspase-3活化。本课题组前期通过检测创伤大鼠心肌组织Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的活性发现,心肌组织Caspase-12活性增加出现最早,且早期活化的Caspase-12是创伤致心肌细胞凋亡的重要原因。然而对于创伤引起Caspase-12早期活化的具体机制尚不明确。Caspase-12作为介导内质网凋亡通路的特异性关键分子,主要通过钙蛋白酶（calpain）途径调控。钙蛋白酶是钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶,有多种亚型,其中calpain-1及calpain-2分布最广泛,且在心肌组织中均有所表达,主要调节各种细胞过程如信号转导、细胞骨架形成、细胞存活和死亡。多种病理状况会导致细胞内钙调节失衡,胞质钙浓度异常性增高形成钙超载,而钙蛋白酶的表达可被细胞内钙超载上调,进而引起一系列细胞反应。然而,在创伤早期心肌组织是否通过激活Ca2+/calpain通路,进而活化Caspase-12仍不清楚。因此,本实验采用Noble-Collip创伤仪制备创伤致继发性心脏损伤模型,探究calpain在创伤早期致心肌细胞凋亡中的作用及可能机制。目的:1.在体水平观察心肌组织calpain的变化,探讨其对创伤早期大鼠心肌组织凋亡蛋白活化的影响。2.离体水平进一步分析calpain在创伤早期致心肌细胞凋亡中的作用及其可能机制。方法:1.在体水平:采用Noble-Collip创伤仪制备创伤致继发性心脏损伤大鼠模型,将雄性SD大鼠（6-8周龄,180 g-220 g）随机分为伪创伤组（n=6）,创伤组（创伤后0 h,3 h,6 h,12 h,24 h各时间点n=6）,创伤+MDL28170组（n=6）。（1）活性试剂盒检测心肌组织Caspase-3及Caspase-12活化水平。（2）Western blot检测心肌组织calpain-1及calpain-2蛋白表达情况。（3）Real-time PCR检测心肌组织calpain-1及calpain-2的mRNA水平。2.离体水平:取伪创伤及创伤后不同时间点的大鼠腹主动脉血清,处理H9C2大鼠心肌细胞制备细胞模型,分为伪创伤组,创伤组（创伤后0 h,3 h,6 h,12 h,24h）,si-calpain-2组,snc-RNA组。（1）Western blot检测心肌细胞calpain-2蛋白表达情况。（2）Real-time PCR检测心肌细胞calpain-2、Caspase-12的mRNA水平。（3）活性试剂盒检测心肌细胞calpain-2、Caspase-12及Caspase-3活化水平。（4）Annexin-Ⅴ-FITC/PI染色检测心肌细胞凋亡情况。（5）激光共聚焦显微镜观察心肌细胞内Ca2+荧光强度的变化情况。（6）流式细胞术检测心肌细胞内Ca2+水平的变化情况。结果:1.创伤大鼠通过上调calpain-2导致心肌组织凋亡蛋白的活化。1.1创伤导致大鼠心肌组织凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-12活性增加。Caspase-3活性试剂盒检测结果表明,大鼠创伤后3 h心肌组织Caspase-3活性显著升高（P<0.05）,至创伤后12 h活性水平达到峰值（P<0.05）,在创伤后24 h活性水平略有下降,但仍具有统计学意义（P<0.05）;Caspase-12活性试剂盒检测结果显示,大鼠创伤后3 h心肌组织Caspase-12活性水平显著增加（P<0.05）,在创伤后6h活性水平最高（P<0.05）,活性水平峰值出现的时间早于Caspase-3。1.2创伤导致大鼠心肌组织calpain-2表达水平增加,calpain-1的表达水平未见明显变化。Western blot结果显示,与伪创伤组相比,创伤组心肌组织calpain-1的蛋白表达并不随创伤时间延长而改变（P>0.05）;心肌组织calpain-2的蛋白表达在创伤后0 h立即升高（P<0.05）,在创伤后3 h达到高峰（P<0.05）。Real-time PCR结果显示,创伤大鼠calpain-1的mRNA水平无时间依赖性,且与伪创伤组相比,无显著差异（P>0.05）;大鼠心肌组织calpain-2在创伤后的mRNA水平变化与蛋白表达结果一致。1.3钙蛋白酶抑制剂MDL28170抑制calpain-2的表达水平而非calpain-1。Western blot结果显示,与伪创伤组相比,创伤组心肌组织calpain-1的蛋白表达无显著差异（P>0.05）,钙蛋白酶抑制剂MDL28170处理创伤大鼠后,与创伤组相比,calpain-1的蛋白表达未抑制,无显著差异（P>0.05）;与伪创伤组相比,创伤组心肌组织calpain-2的表达显著增加（P<0.05）,抑制剂干预创伤大鼠后,显著降低由创伤导致的calpain-2高表达（P<0.05）。Real-time PCR结果显示,与创伤组相比,给予创伤大鼠钙蛋白酶抑制剂后,心肌组织calpain-1的mRNA水平,未见显著变化（P>0.05）;同样方法处理后,钙蛋白酶抑制剂MDL28170显著抑制创伤大鼠心肌组织calpain-2的mRNA水平（P<0.05）。1.4抑制钙蛋白酶表达显著降低Caspase-3及Caspase-12的活性。Caspase-3活性检测结果显示,大鼠创伤后心肌组织Caspase-3活性显著增强（P<0.05）,给予钙蛋白酶抑制剂处理后,显著降低心肌组织Caspase-3的活性水平（P<0.05）;Caspase-12活性检测结果显示,与伪创伤组相比,创伤组大鼠心肌组织Caspase-12活性水平显著升高（P<0.05）,创伤大鼠的钙蛋白酶被抑制后,显著降低心肌组织Caspase-12的活性水平（P<0.05）。2.创伤血清通过激活Ca2+/calpain-2/Caspase-12通路导致心肌细胞凋亡。2.1创伤血清导致心肌细胞calpain-2表达水平增强。Western blot结果显示,与伪创伤组相比,创伤组心肌细胞内calpain-2的蛋白表达明显升高,在创伤后0 h蛋白表达显著增加（P<0.05）,于创伤后3 h calpain-2的蛋白表达最显著（P<0.05）;Real-time PCR结果显示,与伪创伤组相比,创伤24 h内各时间点的心肌细胞calpain-2 mRNA水平均显著升高（P<0.05）。2.2 calpain-2小干扰RNA显著降低创伤组心肌细胞calpain-2的表达水平。Western blot结果显示,calpain-2小干扰RNA显著降低创伤组心肌细胞calpain-2的蛋白表达（P<0.05）;Real-time PCR结果显示,创伤组心肌细胞calpain-2的mRNA水平通过小干扰RNA处理后被显著抑制（P<0.05）。2.3沉默calpain-2基因显著降低心肌细胞calpain-2的表达水平。Western blot结果显示,对于创伤组,calpain-2小干扰RNA显著降低心肌细胞内calpain-2的表达量（P<0.05）;对于伪创伤组,calpain-2小干扰RNA亦可显著降低心肌细胞calpain-2的表达量（P<0.05）,但是伪创伤组calpain-2的抑制程度显著低于创伤组。calpain-2活性试剂盒检测,伪创伤组与创伤组心肌细胞的calpain-2活性水平均可被calpain-2小干扰RNA显著抑制（P<0.05）,并且同Western blot检测结果一致,创伤组的calpain-2活性水平抑制程度较大。2.4干预calpain-2表达显著抑制心肌细胞凋亡蛋白Caspase-12的活化。Real-time PCR结果显示,伪创伤组心肌细胞Caspase-12的mRNA水平未受到calpain-2小干扰RNA的影响（P>0.05）,而创伤组经calpain-2小干扰RNA处理后,心肌细胞Caspase-12的mRNA水平显著降低（P<0.05）。Caspase-12活性试剂盒检测显示,伪创伤组干预calpain-2表达未明显降低心肌细胞Caspase-12的活性（P>0.05）,而创伤组干预calpain-2表达显著降低心肌细胞Caspase-12的活性（P<0.05）。2.5抑制calpain-2基因表达显著降低创伤诱导的心肌细胞凋亡。Annexin-Ⅴ-FITC/PI染色检测结果显示,calpain-2小干扰RNA显著降低创伤组心肌细胞的凋亡率（P<0.05）;Caspase-3活性试剂盒检测显示,calpain-2小干扰RNA显著降低创伤组心肌细胞Caspase-3的活性水平（P<0.05）。2.6创伤导致心肌细胞内Ca2+水平增加。激光共聚焦显微镜观察结果显示,与伪创伤组相比,创伤组心肌细胞内平均荧光强度显著增强（P<0.05）,且创伤后3 h平均荧光强度最显著（P<0.05）;流式细胞术检测结果表明,与伪创伤组相比,创伤组心肌细胞内Ca2+水平随创伤时间延长而增加,于创伤后3 h Ca2+水平达到峰值（P<0.05）,此后略有下降,但仍显著高于伪创伤组,创伤后12 h心肌细胞内Ca2+水平与伪创伤组相比仍具有统计学意义（P<0.05）。结论:创伤早期大鼠心肌组织calpain-1表达水平无明显变化,但calpain-2表达水平显著增加,且calpain-2的上调可能通过Ca2+/calpian-2/Caspase-12通路导致大鼠心肌细胞凋亡。