瘤背石磺(Onchidium reevesii)是典型的底栖生物,隶属于软体动物门,是一种体裸露无贝壳、雌雄同体的两栖性贝类,常分布于中国各个沿海地区,其生存适应温度广、分布区域广阔、野生资源丰富,是一种具有重要营养价值和药用价值的贝类。但由于近年来,我国各海域江河普遍受到不同程度的重金属污染,水生生态系统破坏加剧,势必影响到瘤背石磺的生存环境。重金属的胁迫时间变化对贝类的应激反应、免疫防御系统以及相关基因的功能参与和表达有显著影响。因此,探究贝类的应激活动对镉胁迫的响应及其机制对于贝类预防污染物具有至关重要的意义。本文以瘤背石磺成体为研究对象,分析研究了镉胁迫时间变化下瘤背石磺响应的转录组变化,并检验其防御、信号转导等应激相关基因的相对表达情况;研究了镉胁迫下瘤背石磺金属硫蛋白(metallothionein,MT)的序列、结构和功能及其在各组织中的相对表达变化情况;研究了镉胁迫对瘤背石磺肝胰腺中的酶活性变化趋势以及神经节中递质含量的变化趋势,即对贝类关键生理指标的影响进行了研究,同时,测定了镉胁迫不同时间下瘤背石磺细胞免疫指标的变化,旨在为瘤背石磺成为监测沿海地区重金属污染指示生物的潜在可能提供依据,为上述检测指标作为环境污染早期预警的敏感标志物提供依据,对全面评价污染物对生物的各项潜在影响提供依据,为贝类的生态毒理学研究提供了理论参考。1.瘤背石磺响应镉胁迫的转录组变化通过镉处理不同时间下瘤背石磺神经节的转录组测序分析,组装产生51007个unigenes,其中14774个unigenes被NR,SWISSPROT,KOG,GO,KEGG数据库注释,其中4157(8.15%)unigenes处于5大数据库里的交集。通过GO、KOG功能分类分析,结果发现有3381个unigenes参与瘤背石磺的刺激应答过程;1425个unigenes参与瘤背石磺的信号转导机制;710个unigenes参与瘤背石磺的突触与突触部分;648个unigenes参与瘤背石磺的免疫系统过程。说明镉胁迫能够使瘤背石磺启动应激反应或免疫过程,激活相应的信号传导途径。结合时间序列表达分析聚类比较6个镉胁迫不同时间实验组与对照组,发现响应的转录物聚类成十六个统计学上显着的表达谱,且有5666个unigenes交集在对照组与六个实验组中,其中金属离子结合,突触传递和氧化应激是所鉴定的DEG的主要功能。表达分析揭示了在环境胁迫下,无脊椎动物应答中重要的基因。这是第一份使用高通量测序来表征瘤背石磺对镉暴露反应的报告。该研究为O.reevesii提供了全面的转录本序列资源,并通过Illumina测序平台提供了对非模式海洋无脊椎动物中重金属暴露的基因表达的调查。这些结果可能有助于深入阐明贝类应对海洋污染物反应中涉及的分子机制。2.镉胁迫下瘤背石磺金属硫蛋白的克隆及组织表达分析通过瘤背石磺响应镉胁迫的转录组数据,获得瘤背石磺金属硫蛋白(Or-MT)基因片段序列并进行克隆验证,采用RACE技术获得cDNA全长序列。Or-MT全长1639 bp,包括195 bp的开放阅读框(ORF),共编码了65个氨基酸,分子量为6.48 kDa,理论等电点(PI)7.81。Or-MT氨基酸序列富含半胱氨酸残基(Cys)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)和丝氨酸(Ser),分别为27.7%、16.9%、13.8%和12.3%。将其与家族中相关蛋白的结构域对比,发现Or-MT有着金属硫蛋白典型的高度保守且含量较高的Cys残基,并含有该类型蛋白特有的Cys-X-Cys结构,不含α-螺旋肽段,其空间结构具有两个独立的结构域,彼此单独呈球状,通过氨基酸残基连成哑铃状,以便结合金属,构象坚固。从构建的系统进化树显示,Or-MT与无脊椎动物中的软体动物聚为一支,且与静水椎实螺的MT聚类为一个分支。通过RT-qPCR检测发现,在镉处理的实验组中,瘤背石磺神经节中Or-MT的相对表达量均低于对照组,在镉暴露2 h时基因的相对表达量最低;在瘤背石磺背部组织中Or-MT的相对表达量呈现逐渐升高后降低的趋势,在镉暴露48 h时基因的相对表达量最高,各实验组的Or-MT相对表达量均高于对照组;在瘤背石磺肝胰腺组织中,除镉处理12 h时Or-MT的相对表达量猛增,其表达量几乎是各时间点的两倍外,其他时间点时Or-MT的相对表达量总体趋于平稳;在瘤背石磺腹部组织中,镉处理的实验组Or-MT相对表达量均低于对照组,且各实验组Or-MT相对表达量呈先逐渐上升后下降趋于平稳。总之,瘤背石磺不同组织Or-MT对镉处理时间变化具有不同的反应,增加MT可以结合更多的金属,提高贝类对环境适应能力。但长时间的重金属胁迫会使机体富集,当积累量达到毒性阈值时,会对机体造成一定程度的损伤。3.镉胁迫对瘤背石磺生化毒理效应及细胞免疫影响贝类作为无脊椎动物,仅具有非特异性免疫系统。实验通过流式细胞仪、酶标仪等对瘤背石磺血细胞活性、吞噬活性进行了测定。结果发现,镉胁迫下瘤背石磺实验组的血细胞吞噬率低于对照组的血细胞吞噬率,受抑制,该趋势与重金属胁迫浓度有关;在镉暴露12 h时,血细胞吞噬率明显低于对照组,且此时吞噬活力抑制率为31.62%。镉处理不同时间下,瘤背石磺血细胞存活率均高于对照组,猜测在镉胁迫下机体Cd不断缓慢积累,加快了血细胞的摄取和消除速率(或Cd转运),在12 h、48 h时,镉诱导的血细胞存活率显著降低。以瘤背石磺的血淋巴、肝胰腺组织和神经节为研究对象,对镉影响瘤背石磺抗氧化酶(SOD)、代谢酶(AST)的活性变化以及神经递质(ACh)的含量变化进行了研究,结果发现在重金属处理下,瘤背石磺肝胰腺中SOD的活性有所上升,可能是镉胁迫导致机体活性氧自由基大量积累,机体抗氧化酶活性因此增强,使机体启动免疫防御系统;除镉处理4 h时SOD的活性小于对照组外,其余时间点上的实验组SOD的活性高于对照组,且在24 h以后实验组中的SOD的活性趋于稳定。AST在肝胰腺中与解毒作用尤为相关,在重金属镉处理下,瘤背石磺肝胰腺中AST的活性呈波浪式,胁迫2 h和24 h时AST活性高于对照组,其余实验组AST活性均低于对照组。Ach作为一种必需的小分子神经递质,在镉胁迫下瘤背石磺神经节中Ach含量低于对照组;在胁迫2 h时神经节中的Ach含量急剧降低,与对照组含量相比占其20.57%,胁迫24 h以后,实验组神经节中的Ach含量不断下降。以上指标属于敏感标志物,可用于早期预警。这些结果可帮助了解镉胁迫下处理不同时间的贝类的免疫机制,也将有助于了解镉胁迫对贝类生理生化活动的响应机制,进一步评估镉胁迫不同时间下机体的适应性以及机体的损伤程度。