脑缺血再灌注损伤为脑中风、脑创伤、脑肿瘤等很多疾病的基本病理生理学基础。在缺血中心区周围,损伤的脑组织具有一定恢复和修复能力,这部分可以被“挽救”的脑组织称为缺血半暗带(Ischemic penumbra,IP),是治疗缺血性脑血管病竭力挽救的区域,也成为临床治疗脑卒中的关键区域。研究表明,近年来新发现的髓磷脂相关抑制因子的共受体,即成对性免疫球蛋白样受体B(Paired immunoglobulin-like receptor B,Pir B)在脑缺血再灌注损伤后损伤区内表达上调可能是导致轴突再生抑制、突触可塑性下降和加重神经元损伤的重要因素之一。因此,阻断Pir B受体信号通路是促进轴突再生、突触可塑性恢复和神经元存活的有效途径。然而,基因水平干涉或抑制Pir B表达很难应用于临床实践,而蛋白质药物虽然可以较好的临床应用,但因其分子量较大,往往难以通过血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)在脑损伤区内发挥作用,影响了治疗效果。在本研究中,我们首先利用MCAO模型,发现神经元Pir B在SD大鼠大脑皮层IP内表达显著上调,并持续至再灌注后第28 d。体外实验进一步发现,通过pirb RNAi干涉Pir B表达后,可以促进氧糖剥夺后神经元轴突生长和神经元存活。随后,我们利用蛋白转导技术和重组蛋白融合技术将转录反式激活因子(Trans-activator of transcription,TAT)转导蛋白结构与Pir B受体胞外段(Pir B extracellular peptide,PEP)重组,制备并表达了新型可溶性融合蛋白TAT-PEP。体外实验表明,其与MAG、OMgp、Nogo-A具有较好的亲和力,并可以逆转它们的抑制效应,促进轴突生长。体内实验显示,其经腹腔注射后可以通过BBB并分布于皮层IP内。TAT-PEP能够减少MCAO后脑梗死容积,促进MCAO后模型动物长期的神经功能恢复。研究进一步发现,TAT-PEP可以促进轴突再生和皮质脊髓束重塑,加强突触可塑性。体外实验也证实,TAT-PEP能够促进OGD后神经突起生长,减轻生长锥崩溃瓦解。这些作用的机制可能与TAT-PEP通过阻遏髓磷脂抑制因子与Pir B的结合,抑制下游分子POSH和Rho A表达,进而促进GAP43表达有关。此外,我们还发现TAT-PEP可以通过减轻缺血再灌注后神经元变性和凋亡,发挥神经保护作用,其机制可能与TAT-PEP通过影响Bax和Bcl-2表达,进而抑制线粒体相关的Caspase3活化有关。这些发现提示,缺血再灌注损伤后神经元Pir B呈现高表达,对神经元造成严重损害。TAT-PEP通过阻遏MAG、OMgp、Nogo-A与Pir B的作用,进而抑制Pir B功能,发挥神经保护作用。综上所述,该研究明确了Pir B在SD大鼠大脑皮层半暗带内的时空表达变化,为缺血性脑卒中的治疗提供了新的靶点;首次提出并证实通过制备含有Pir B胞外段的新型融合蛋白TAT-PEP,阻遏Nogo-A、MAG、OMgp与Pir B的作用,从而促进缺血再灌注后神经功能恢复,为临床上促进缺血性脑损伤后神经功能恢复和缺血性脑卒中的治疗提供了新的策略;首次探讨并阐明TAT-PEP促进脑缺血再灌注损伤后轴突再生,突触可塑性恢复,皮质脊髓束重塑以及减轻神经元凋亡的作用及相关机制,为TAT-PEP可能的临床应用提供了理论依据和实验基础。第一部分Pir B在SD大鼠大脑皮层半暗带内的时空表达及干涉Pir B表达对氧糖剥夺后皮层神经元损伤的改善作用目的:1.明确SD大鼠MCAO模型大脑皮层半暗带内Pir B的时空表达情况。2.干涉Pir B表达对氧糖剥夺后神经元轴突生长的作用。3.干涉Pir B表达对氧糖剥夺后神经元存活和凋亡的作用。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为8组,每组10只,分为正常对照组(Normal组,没有任何处理),假手术组(Sham组,只分离血管但不留置线栓)和模型组(MCAO组,根据实验的时间点分为1 d post-MCAO组,3 d post-MCAO组,7 d post-MCAO组,14 d post-MCAO组,21 d post-MCAO组,28 d post-MCAO组)。由于MCAO模型造膜成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用的动物样本量为6只,即每组n=6,随机抽取。Western Blot检测MCAO后不同时间点大脑皮层半暗带内Pir B蛋白表达。其中,Normal组和Sham组在MCAO后1 d时取材,其余各组分别在MCAO后第1 d,3 d,7 d,14 d,21 d,28 d时取材。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为2组,每组10只,根据1实验的结果,分为假手术组(Sham组,只分离血管但不留置线栓)和模型组(MCAO组)。由于MCAO模型造膜成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用的动物样本量为6只,即每组n=6,随机抽取。于再灌注后第28 d时应用免疫荧光组织化学双标记染色方法检测大脑皮层半暗带内Pir B蛋白的表达和定位。3.pirb基因干涉靶点筛选与慢病毒包装由上海英为信生物科技有限公司完成。SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元随机分为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+control RNAi组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d鉴定后,行OGD,复氧复糖后转染GPH-PIRB-294慢病毒,在OGD复氧复糖72 h时,Western blot分别检测神经元Pir B表达和GFP表达。4.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+control RNAi组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d鉴定后,行OGD,复氧复糖后转染GPH-PIRB-294慢病毒,在OGD复氧复糖72 h时,免疫荧光细胞化学染色检测神经元轴突长度。5.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元随机分为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+control RNAi组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d鉴定后,行OGD,复氧复糖后转染GPH-PIRB-294慢病毒,在OGD复氧复糖72 h时,MTT检测神经元神经元活力,TUNEL染色检测神经元凋亡情况。结果:1.再灌注后第1 d时,Normal组和Sham组的Pir B表达没有统计学差异(p>0.05)。与Sham组相比,1 d post-MCAO组,3 d post-MCAO组,7 d post-MCAO组,14 d post-MCAO组,21 d post-MCAO组,28 d post-MCAO组大脑皮层半暗带内Pir B蛋白表达明显增加(p<0.05)。双重荧光免疫组织化学染色进一步显示,与Sham组相比,再灌注后28 d时实验动物大脑皮层半暗带内Pir B表达显著增加(p<0.05),且与Neu N呈现明显的双标记,提示在缺血再灌注后28 d时实验动物大脑皮层半暗带内神经元Pir B表达显著增加。2.Western blot结果显示,与Normal组相比,OGD后第72 h时,OGD组和OGD+control RNAi组神经元Pir B表达明显增加(p<0.05)。与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组神经元Pir B表达明显减少(p<0.05)。3.免疫荧光细胞化学染色结果显示,与Normal组相比,OGD后第72 h时,OGD组和OGD+control RNAi组神经元最长突起即轴突的平均长度明显变短(p<0.05)。与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组神经元神经元轴突长度明显变长(p<0.05)。4.在OGD后72 h时,应用MTT比色法检测神经元细胞活力,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值显著降低(P<0.05),与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组的MTT相对比色值增加(P<0.05)。与OGD组相比,OGD+control RNAi组的MTT相对比色值没有统计学意义(P>0.05)。在OGD后72 h时,OGD组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显多于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显减少(P<0.05),与OGD组相比,OGD+control RNAi组的TUNEL阳性神经元的细胞数目没有统计学意义(P>0.05)。结论:通过制备SD大鼠MCAO模型,发现在MCAO后28 d内大脑皮层半暗中PirB表达都明显升高;通过干涉神经元Pir B表达的慢病毒系统,发现抑制OGD后神经元Pir B表达,可以有效促进轴突生长,增强神经元活力,减轻神经元凋亡。该部分结果不仅阐明了Pir B在SD大鼠MCAO模型大脑半暗带内的表达变化趋势,还证实了Pir B在神经元OGD后的作用及功能,为脑缺血再灌注损伤的机制研究提供了新的理论基础和实验依据,为其防治策略的研究提供了新的思路和新的靶点。第二部分可溶性融合蛋白TAT-PEP的制备、表达、纯化及生物学活性的鉴定目的:1.可溶性融合蛋白TAT-PEP的制备、表达、纯化。2.可溶性融合蛋白TAT-PEP生物学活性的鉴定。方法:1.可溶性融合蛋白TAT-PEP制备由南京金斯瑞科技有限公司完成。用GE公司蛋白纯化系统纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western blot检测纯化后的TAT-PEP。SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元随机分为5组,即Normal组,TAT-m PEP(100μg/L)组,TAT-PEP(50μg/L)组,TAT-PEP(100μg/L)组,TAT-PEP(200μg/L)。原代培养的皮层神经元给予蛋白处理后3 d时,MTT检测神经元活力;LDH释放实验检测神经元存活。2.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。将Nogo-A(AP-Nogo-66,R&D,300 ng/spot);MAG(MAG-Fc,R&D,150 ng/spot);OMgp(AP-OMgp,R&D,300 ng/spot)以50μg/well分别包被于96孔板中,4℃孵育24 h,按浓度梯度分别加入0,0.005,0.01,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32μmol/L TAT-PEP或者TAT-m PEP,并设PBS对照,37℃孵育4 h,随后加入兔抗(His)6多克隆抗体及羊抗兔Ig G二抗,ELISA法检测吸光度(OD)值。3.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。将Nogo-A(AP-Nogo-66),MAG(MAG-Fc),OMgp(AP-OMgp)(50 ng/well)分别或混合(MAIs)包被24孔板的玻片中,在4℃条件下孵育24 h。之后按50μg/L,100μg/L,200μg/L分别加入TAT-PEP或TAT-m PEP(500μl),37℃孵育2 h,接种皮层神经元,培养至第7 d时免疫荧光细胞化学染色检测神经元最长突起的平均长度。4.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g。造模成功的大鼠随机分为4组,每组4只,即0 mg/kg TAT-PEP组,0.05 mg/kg TAT-PEP组,0.5 mg/kg TAT-PEP组和1.0 mg/kg TAT-PEP组。根据前期研究及预实验结果,在MCAO后立刻给予0 mg/kg(为蛋白稀释液即三蒸水),0.05 mg/kg,0.5 mg/kg和1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,并于注射后24 h时行免疫荧光组织化学染色检测TAT-PEP在皮层半暗带的分布及蛋白量。5.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g。造模成功的大鼠随机分为7组,每组4只,即TAT-PEP腹腔注射后0 h组,0.5 h组,2 h组,12 h组,24 h组,48 h组和72 h组。在再灌注后立刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射(根据上述免疫荧光组织化学染色结果),并于注射后0 h,0.5 h,2 h,12 h,24 h,48 h和72 h后Western Blot检测TAT-PEP在皮层半暗带的蛋白量。结果:1.考马斯亮蓝染色及Western blot结果显示,TAT-PEP的分子量约为90KDa,与预期相符合。2.各组MTT实验相对OD值没有统计学差异(P>0.05),LDH释放量相对值也没有统计学差异(P>0.05)。3.ELISA结果显示,与TAT-m PEP组相比,不同浓度TAT-PEP与Nogo-A(Nogo66)反应后,其OD值呈现明显的剂量效应关系,说明TAT-PEP与Nogo-A(Nogo66)分子有很好的结合能力。还发现不同浓度TAT-PEP与商品化的MAG,OMgp反应后,其OD值也呈现明显的剂量效应关系。4.与Normal组相比,Nogo-A(Nogo66)组神经元最长突起的平均长度明显缩短(P<0.05),而TAT-PEP组神经元最长突起的平均长度与Nogo-A(Nogo66)组相比明显变长(P<0.05),TAT-m PEP组神经元最长突起的平均长度与Nogo-A(Nogo66)组相比没有统计学意义(P>0.05)。实验进一步观察到,与Normal组相比,MAG组神经元最长突起的平均长度明显缩短(P<0.05),而TAT-PEP组神经元最长突起的平均长度与MAG组相比明显变长(P<0.05),TAT-m PEP组神经元最长突起的平均长度与MAG组相比没有统计学意义(P>0.05)。OMgp组别也观察到类似的现象。5.MAIs(Nogo66+MAG+OMgp)组与Normal组相比,神经元最长突起的平均长度明显缩短,TAT-m PEP组神经元最长突起的平均长度与MAIs组相比没有统计学意义(P>0.05)。与MAIs组相比,50μg/L的TAT-PEP处理组后,神经元最长突起的平均长度明显变长(P<0.05),100μg/L的TAT-PEP组与50μg/L的TAT-PEP组相比,神经元最长突起的平均长度明显变长(P<0.05),而200μg/L的TAT-PEP组与100μg/L的TAT-PEP组相比神经元最长突起的平均长度没有统计学意义(P>0.05)。6.免疫荧光组织化学染色结果显示,0 mg/kg TAT-PEP组未检测到(His)6阳性反应物,0.05 mg/kg TAT-PEP组仅检测到少量的(His)6阳性反应物,0.5 mg/kg TAT-PEP组和1.0 mg/kg TAT-PEP组检测到大量的(His)6阳性反应物,1.0 mg/kg TAT-PEP组的(His)6阳性反应物要多于0.5 mg/kg TAT-PEP组(P<0.05)。7.Western blot结果显示,蛋白注射后12 h时,皮层内TAT-PEP水平达峰值,24h时明显减少,随着时间的推移其量逐渐下降。结论:本部分实验通过成功制备含有TAT结构,(His)6和Pir B胞外段结构的可溶性融合蛋白TAT-PEP,证实其能够与Nogo-A(Nogo66)、MAG、OMgp结合并逆转他们的抑制效应。该实验还表明TAT-PEP腹腔注射后,TAT结构能够使TAT-PEP融合蛋白有效通过血脑屏障,并且分布于皮层半暗带内。同时,该实验也明确了蛋白的给药时间,即每日腹腔注射浓度为1.0 mg/kg的TAT-PEP,为下一步TAT-PEP的功能研究奠定了基础。第三部分TAT-PEP对SD大鼠MCAO后脑梗死容积和神经功能的影响目的:1.研究TAT-PEP对局灶性脑缺血损伤后脑梗死容积的作用。2.研究TAT-PEP对局灶性脑缺血损伤后神经功能恢复的作用。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行Garcia评分和TTC染色实验。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行神经功能缺损评分和磁共振成像实验。3.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行错步分析实验、转轴实验。4.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行肢体放置实验和运动诱发电位实验。结果:1.MCAO后24 h的Garcia评分结果显示,与Sham组相比,MCAO组神经功能评分显著降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组神经功能评分没有显著差异(P>0.05)。MCAO后48 h和72 h的Garcia评分结果显示,与Sham组相比,MCAO组神经功能评分显著降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组神经功能评分显著提高(P<0.05)。TTC染色结果显示,MCAO后72 h时,与Sham组相比,MCAO组实验动物出现明显的脑梗死。与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组实验动物脑梗死容积明显变小(P<0.05)。2.MCAO后3 d,7 d和28 d的T2WI图像显示,MCAO组脑缺血侧有明显的高密度影区,而MCAO+TAT-PEP组脑缺血侧的高密度影区较MCAO组有所减少(P<0.05)。MCAO后7 d,14 d,21 d和28 d时各组的m NSS评分结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的m NSS评分显著增加(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组各时间点的m NSS评分显著降低(P<0.05)。3.错步分析结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的错步次数显著增加(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组在7 d,14 d,21 d和28 d的错步次数显著降低(P<0.05),而第在2 d时与MCAO组相比没有统计学差异(P>0.05)。转轴实验结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的在转轴上停留的时间显著减少(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组在7 d,14 d,21 d和28 d的在转轴上停留的时间显著增加(P<0.05),而第在2 d时与MCAO组相比没有统计学差异(P>0.05)。肢体放置结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的肢体放置评分明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组在MCAO后7 d,14 d,21 d和28 d时肢体放置评分明显增加(P<0.05),在MCAO后2 h时没有明显差别(P>0.05)。4.运动诱发电位(MEP)结果显示,在MCAO后28 d时,与Sham相比,MCAO组左前肢体MEP的振幅明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组左前肢体MEP的振幅明显增加(P<0.05);与Sham相比,MCAO组左后肢体MEP的振幅明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组左后肢体MEP的振幅明显增加(P<0.05)。结论:本部分实验主要通过核磁共振成像技术和多种神经行为学方法,明确了TAT-PEP可以显著促进实验动物MCAO后感觉和运动功能的恢复,为TAT-PEP的可能的临床应用奠定了实验基础,也为下一步的机制研究提供了丰富线索。第四部分TAT-PEP对脑缺血再灌注损伤后轴突再生、皮质脊髓束和突触可塑性重塑的作用及机制研究目的:1.研究TAT-PEP对MCAO后皮质脊髓束重塑的作用。2.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内轴突再生的作用。3.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内突触可塑性的作用。4.研究TAT-PEP对OGD后神经元轴突生长和生长锥瓦解的作用。5.阐明TAT-PEP上述作用的分子机制。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注14 d时进行BDA皮层定位注射,在再灌注后21 d时,观察注射区的BDA被神经元摄取情况。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注14 d时进行BDA皮层定位注射,在再灌注后28 d时,观察皮质脊髓束重塑情况。3.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,观察大脑皮层半暗带内NF200,MAP2,SYN表达情况。4.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,Western blot观察大脑皮层半暗带组织内POSH,Rho A,GAP43,GAPDH表达情况。5.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。原代培养的皮层神经元接种24 h后,行OGD。OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,24 h后利用活细胞工作站观察神经元轴突生长和分支点数量情况。6.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。原代培养的皮层神经元至第7 d时,行OGD,OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,3 d后利用明场显微镜观察神经元最长神经突起的平均长度和最长神经突起的分支点点数量。7.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。原代培养的皮层神经元至第7 d时,行OGD,OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,3 d后利用GAP43抗体行免疫荧光细胞化学染色观察生长锥情况。8.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+TAT-PEP组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d时,行OGD,OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,之后第3 d时应用Western blot检测TAT-PEP对神经元POSH,Rho A,GAP43表达的作用。结果:1.在MCAO后14 d时,神经轴突示踪剂由未损伤的皮层处注入。在MCAO后21 d时,注射区的BDA被神经元及轴突摄取,注射区内大脑皮层的神经元锥体细胞及其轴突呈现广泛的BDA阳性荧光显影,且存在大量Neu N与BDA双标记的神经元,说明示踪剂注射成功。在MCAO后28 d时,被摄取的BDA沿着皮质脊髓束长距离顺行传输到颈膨大处。MCAO+TAT-PEP组中,检测皮质脊髓束在同侧灰质中的BDA阳性纤维密度明显高于MCAO组(P<0.05),其新生轴突横穿中线到达对侧的数量也明显多于MCAO组(P<0.05)。2.在MCAO后28 d时的NF200与Neu N免疫荧光双标记实验显示,MCAO组半暗带内NF200表达低于Sham组(P<0.05),MCAO+TAT-PEP组中半暗带内NF200表达则明显高于MCAO组(P<0.05)。3.在MCAO后28 d时MAP2免疫荧光单标记实验显示,MCAO组半暗带内MAP2表达低于Sham组(P<0.05),MCAO+TAT-PEP组中半暗带内MAP2表达则明显高于MCAO组(P<0.05)。4.在MCAO后28 d时的SYN与Neu N免疫荧光双标记实验显示,SYN表达于神经元胞体周围,MCAO组半暗带内SYN表达明显低于Sham组(P<0.05),MCAO+TAT-PEP组中半暗带内SYN表达则明显高于MCAO组(P<0.05)。5.MCAO后28 d时MCAO组POSH和Rho A的表达显著高于Sham组(P<0.05),而GAP43的表达显著低于Sham组(P<0.05)。与此相反,MCAO+TAT-PEP组POSH和Rho A的表达显著低于MCAO组(P<0.05),而GAP43的表达显著高于MCAO组(P<0.05)。6.活细胞工作站观察TAT-PEP对神经元轴突生长和分支形成的作用。结果显示,OGD+TAP-PEP组神经元最长突起在单位时间内的生长情况明显优于OGD组(P<0.05),同时该组神经元最长突起上的分支点数量明显多于OGD组(P<0.05)。7.在OGD后3 d时,明场显微镜观察结果显示,OGD组神经元最长突起的平均长度显著短于Normal组(P<0.05),而OGD+TAT-PEP组神经元最长突起的平均长度则显著长于OGD组(P<0.05),研究进一步发现OGD组神经元最长突起的分支点数量显著少于Normal组(P<0.05),而OGD+TAT-PEP组神经元最长突起的分支点数量则显著多于OGD组(P<0.05)。8.在OGD后3 d时,Normal组神经元生长锥崩溃瓦解水平仅为20%,而OGD组生长锥崩溃瓦解水平则可达到60%,显著高于Normal组(P<0.05),OGD+TAP-PEP组生长锥崩溃瓦解水平为38%,显著低于OGD组(P<0.05)。9.OGD后3 d时Western blot结果显示,OGD组POSH和Rho A的表达显著高于Normal组(P<0.05),而GAP43的表达显著低于Normal组。与此相反,OGD+TAT-PEP组和OGD+pirb RNAi组POSH和Rho A的表达显著低于OGD组,而GAP43的表达显著高于OGD组(P<0.05)。而OGD+TAT-PEP组与OGD+pirb RNAi组中神经元POSH、Rho A和GAP43的表达没有显著差异(P>0.05)。结论:本部分实验通过在体MCAO模型和离体OGD模型,利用顺行神经示踪技术、免疫荧光组织化学染色方法,活细胞工作站及神经电生理等多种方法,发现并证实TAT-PEP可以通过干预Pir B下游的POSH/ROCK/GAP43信号通路,促进MCAO后大脑皮层半暗带内轴突再生和突触可塑性恢复,促进皮质脊髓束的重塑,从而发挥改善神经功能特别是感觉和运动功能的作用。该部分研究不仅阐明了TAT-PEP发挥神经保护作用的部分机制,还间接揭示了Pir B在脑缺血再灌注损伤中的作用和机制,为缺血性脑中风的治疗提供了新的作用靶点,为TAT-PEP可能的临床应用提供了理论依据和实验基础。第五部分TAT-PEP对脑缺血再灌注损伤后皮层半暗带内神经元变性和凋亡的作用及机制研究目的:1.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内神经元存活及凋亡的作用。2.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内神经元超微结构的作用。3.研究TAT-PEP对OGD后神经元存活及凋亡的作用,并探讨相关机制。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,分别进行Nissl,FJC及免疫荧光组织化学染色。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,进行TUNEL染色。3.实验动物随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,制备超薄切片,在电镜下观察神经元超微结构。4.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为6组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+TAT-PEP(50μg/L)组,OGD+TAT-PEP(100μg/L)组,OGD+TAT-PEP(200μg/L)组,OGD+TAT-m PEP(100μg/L)组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP或TAT-m PEP处理。MTT及LDH释放实验检测不同浓度TAT-PEP对OGD后24 h时神经元存活的作用。5.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为4×3组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+TAT-PEP(100μg/L)组和OGD+TAT-m PEP(100μg/L)组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP或TAT-m PEP处理。MTT及LDH释放实验检测TAT-PEP对OGD后6 h,24 h,72 h时神经元存活的作用。6.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP(100μg/L)处理。TUNEL染色检测TAT-PEP对OGD后72 h时神经元凋亡的影响。7.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP(100μg/L)处理。Western blot检测TAT-PEP对OGD后72 h时神经元凋亡相关蛋白表达的影响。结果:1.MCAO后3 d时,与Sham组相比,MCAO组半暗带内神经元存活数量显著减少(P<0.05),而TAT-PEP治疗后能够显著增加神经元存活的数量(P<0.05)。Neu N免疫荧光组化染色结果进一步显示,MCAO后3 d时,与Sham组相比,MCAO组半暗带内Neu N阳性神经元数量显著减少(P<0.05),而TAT-PEP治疗后能够显著增加Neu N阳性神经元的数量(P<0.05)。2.与Sham组相比,MCAO组半暗带内FJC阳性神经元数量显著增多(P<0.05),而TAT-PEP治疗后FJC阳性神经元的数量明显减少(P<0.05)。TUNEL染色结果进一步显示,MCAO后3 d时,与Sham组相比,MCAO组半暗带内TUNEL阳性神经元数量显著增多(P<0.05),而TAT-PEP治疗后TUNEL阳性神经元的数量明显减少(P<0.05)。3.MCAO后3 d时结果发现,与Sham组相比,神经元超微结构明显变化。具体体现在,神经元细胞核明显固缩,染色质降解,边集,核膜皱缩、破裂。细胞质中粗面内质网呈囊性变、脱颗粒,特别是线粒体明显肿大,呈囊泡状改变,发生嵴断裂和基粒脱失的改变。而TAT-PEP治疗后可以显著改善神经元超微结构,特别是线粒体的结构。4.在OGD后24 h时,与Normal组相比,OGD组MTT的相对比色值显著降低(P<0.05),50μg/L,100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理后可以显著提高MTT的相对比色值(P<0.05),而OGD+TAT-m PEP组的MTT的相对比色值与OGD组相比没有统计学意义(P>0.05)。结果进一步显示,与50μg/L的TAT-PEP处理组相比,100μg/L的TAT-PEP处理后可以提高MTT的相对比色值(P<0.05),而100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理组之间的MTT相对比色值没有统计学意义(P>0.05)。该结果说明TAT-PEP可以有效增强OGD后神经元活力,并且这种作用具有剂量依赖性。5.在OGD后24 h时,与Normal组相比,OGD组LDH释放量的相对值显著升高(P<0.05),50μg/L,100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理后可以显著降低LDH释放量的相对值(P<0.05),而OGD+TAT-m PEP组的LDH释放量的相对值与OGD组相比没有统计学意义(P>0.05)。结果进一步显示,与50μg/L的TAT-PEP处理组相比,100μg/L的TAT-PEP处理后可以降低LDH释放量的相对值(P<0.05),而100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理组之间的LDH释放量的相对值没有统计学意义(P>0.05)。该结果说明TAT-PEP可以有效减轻OGD后神经元损伤程度,并且这种作用具有剂量依赖性。6.在OGD后6 h时,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值降低(P<0.05),LDH释放量相对值增加(P<0.05)。在OGD后24 h时,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值显著降低(P<0.05),LDH释放量相对值显著增加(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组的MTT相对比色值增加(P<0.05)和LDH释放量相对值降低(P<0.05)。在OGD后72 h时,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值显著降低(P<0.05),LDH释放量相对值显著增加(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组的MTT相对比色值增加(P<0.05)和LDH释放量相对值降低(P<0.05)。7.在OGD后72 h时,OGD组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显多于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显减少(P<0.05)。8.在OGD后72 h时,OGD组凋亡蛋白Bax表达明显多于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组凋亡蛋白Bax表达明显减少(P<0.05)。同时,OGD组抗凋亡蛋白Bcl2表达明显少于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组抗凋亡蛋白Bcl2表达明显增加(P<0.05)。研究还发现OGD组活化的Caspase3水平明显高于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组活化的Caspase3水平明显降低(P<0.05)。结论:本部分实验通过利用在体大鼠MCAO模型和离体OGD模型及多种神经科学研究方法,发现TAT-PEP能够减轻皮层半暗带内神经元变性和凋亡,改善其超微结构,发挥神经保护作用。TAT-PEP能够加强OGD后皮层神经元的存活,减少LDH的释放,减轻神经元凋亡和损伤,相关机制可能与其干扰Nogo-A等与Pir B结合,影响下游信号通路,从而抑制Bax表达,促进Bcl-2表达,抑制线粒体通透性转换孔开放和Caspase3的激活有关。该实验阐明了Pir B在缺血再灌注损伤致神经元凋亡的新机制,为缺血再灌注损伤的临床治疗提供了新的干预靶点和有效策略,为TAT-PEP的神经保护作用及机制研究提供了理论依据和实验基础。