研究背景：转移和复发是临床上大多数恶性肿瘤患者死亡的主要因素。研究表明，90%以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。而传统治疗方案，无论是手术治疗还是放射治疗和化学治疗，都难以保证将晚期或转移的恶性肿瘤细胞彻底消灭。近年来，研究人员将根治恶性肿瘤的希望寄托于肿瘤基因治疗策略。现在研究人员关注的焦点是如何能够激发机体针对特异性肿瘤抗原的更强并且更加有效的免疫反应。研究目的：本课题目标是研制新型抗肿瘤腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB，通过多种机制协同发挥作用，打破免疫耐受和实现免疫增效。方法：1.将前期构建的sig-eTERT-Fc-GPI-IRES-GM/B7复合基因片段运用分子克隆技术连入AdEasy-1/F11p改良腺病毒载体得到Ad5F11p-eTERTFcGB重组质粒。利用脂质体介导转染293细胞，获得Ad5F11p-eTERTFcGB原代病毒。大量扩增腺病毒，采用阴离子交换层析技术纯化获得体内试验级别的腺病毒产品。2.将hTERT（538aa-875aa）基因片段构建到原核表达载体pET-42a中，IPTG诱导并纯化hTERT蛋白，通过Western Blot和ELISA检测纯化后的hTERT蛋白的免疫原性。3.构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc，共转染小鼠黑色素瘤B16细胞，经抗生物加压筛选出阳性克隆，Western blot、流式细胞术及免疫荧光检测hTERT和Luc在B16细胞中的表达；将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过皮下注射和尾静脉注射的方式接种C57BL/6小鼠，建立小鼠皮下荷瘤模型和肿瘤肺转移模型。4.建立小鼠皮下荷瘤模型和肺部肿瘤转移模型，抗肿瘤腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB采用肌肉注射免疫小鼠，观察抑瘤效果，并对其免疫学机制进行初步的研究： ELISA检测小鼠血清中的特异抗体和细胞因子的水平；LDH法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应； ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ的分泌；流式细胞术检测小鼠的脾细胞NK细胞及CD4+/CD8+T细胞分型；免疫荧光检测肿瘤组织中浸润的CD8+T；对肿瘤组织及睾丸进行病理组织切片染色观察肿瘤局部免疫微环境及免疫后小鼠其他组织有无免疫损伤。结果：1.成功构建了Ad5F11p-eTERTFcGB重组质粒，转染293细胞后，成功包装出原代腺病毒。采用Q Sepharose XL阴离子交换层析技术纯化获得体内试验级别的腺病毒产品。经验证Ad5F11p-eTERTFcGB重组腺病毒感染细胞后，可以很好的表达eTERTFc融合抗原、GM/CSF免疫佐剂和B7.1共刺激因子。2.成功构建原核表达质粒pET-42a-hTERT，纯化出大小约为65KD的融合蛋白；Western Blot和ELISA检测显示纯化后的hTERT蛋白具有很好的免疫原性。3.成功构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc，建立了稳定共表达hTERT和Luc的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株B16-hTERT/Luc；成功建立了荷瘤小鼠模型。4.腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB免疫后，发现与对照组相比疫苗组成瘤时间延长6d，小鼠肿瘤生长受到明显抑制；疫苗组小鼠体内产生较高浓度的hTERT特异性抗体；可以检测到疫苗组小鼠血清细胞因子IL-2和IFN-γ的增加，特异性的分泌IFN-γ的淋巴细胞达581±62SFU/106个脾淋巴细胞；疫苗组淋巴细胞与对照组相比对肿瘤细胞的杀伤效率明显增加，在效靶比为40:1、20:1和10:1时，CTL的杀伤率分别为61.4%、45.8%和35.3%。在疫苗组免疫的小鼠肿瘤组织中可以检测到CD8+T细胞的浸润。小鼠体内低量表达TERT的睾丸组织病理切片中没有发现自身免疫性炎症反应和组织损伤的证据。结论：构建的新型抗肿瘤腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB与对照组相比在小鼠体内可以诱导产生更强的细胞免疫反应和体液免疫反应，能够抑制移植瘤的生长，为恶性肿瘤生物免疫治疗的免疫增效的研究提供了一些有益的借鉴。