近年来,随着人类基因组计划的进展,有关疾病与基因多态性关系的研究日益受到重视。研究证实,基因组序列上的变异,即基因多态性(gene polymorphism)是决定人体对应激易感性与耐受性、临床表型多样性及药物治疗反应差异性的重要因素。因此,发现与多基因疾病易感性相关的基因对于临床上采取个性化治疗具有重要意义。TLR4是九十年代末发现的LPS的最重要的模式识别受体,它是将LPS的刺激信号直接传入细胞内的一种跨膜信号受体,在介导革兰氏阴性细菌及其LPS的宿主反应中发挥关键作用。因此,其基因表达上的差异,很可能是部分患者易发生脓毒症或/和预后较差的重要因素。GR是一种配体激活的内源性转录因子,它不仅影响机体创伤后的应激和炎症反应,还与糖皮质激素抵抗的发生机制密切相关。为此,基于目前研究进展,本课题拟重点开展以下五方面的系统研究:(1)用单管双向等位基因特异性扩增(single-tube bi-directional allele specific amplification,SB-ASA)及PCR-限制性片段长度多态法(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分别分析TLR4基因3′UTR11 367G→C、编码区+896A→G碱基变异及GR基因编码区ER22/23EK、N363S、内含子区Bcl ?五个SNP位点在重庆地区部分人群中的发生频率及其SNP基因型分布特点;(2)分别用流式细胞仪、实时定量PCR及酶联免疫吸附实验(ELISA)观察TLR4基因3′UTR11 367G→C不同等位基因个体全血在LPS刺激后TLR4表达及TNF-α分泌水平的差异;(3)利用基因克隆及定点突变技术,探讨TLR4基因3′UTR11 367G→C碱基变异的功能;(4)本研究还对ISS评分大于16分的100例(ISS 31.2±8.5)严重创伤病人进行基因分型,以了解TLR4基因3′UTR 11 367G→C及GR基因内含子区Bcl ? C→G两个多态性位点与严重创伤后伤情发展及预后间的关系;(5)分析GR基因内含子区Bcl I多态性位点对激素性高眼压发生率的影响。旨在为揭示多基因疾病发病易感性的分子基础提供实验及临床应用依据。主要结果和结论如下:1.对269名重庆地区部分汉族健康人群的SNP调查分析结果显示,存在TLR4基因3′UTR11 367位点G→C及GR基因内含子区Bcl ?位点C→G碱基变异,发生频率分别为13.01%和23.50%,均为高频SNP,所选人群符合Hardy-Weinberg平衡(p=0.06和0.43)。未发现TLR4基因编码区+896位点的A→G及GR基因编码区ER22/23EK位点的G→A、N363S位点的T→G碱基变异。2.LPS刺激后,TLR4蛋白及mRNA表达均显著增加,TLR4基因3′UTR11 367位点三种基因型粒细胞的TLR4蛋白及mRNA表达相差有显著性意义,其中GG纯合子TLR4蛋白及mRNA表达增加显著高于基因型GC和CC,而TLR4蛋白表达在基因型GC和CC之间差异不显著。3.以LPS刺激不同基因型个体全血,TLR4基因3′UTR11 367位点不同基因型个体血浆TNF-α水平存在明显差异,其中GG纯合子TNF-α水平显著高于基因型GC和CC,而基因型GC和CC之间差异不显著。4.通过基因克隆和定点突变技术,构建了含TLR4基因3′UTR及11 367位点突变质粒,双荧光报告系统检测结果显示,在HEK293细胞中,pGL3-11 367 G荧光素酶活性显著高于pGL3-11 367C;定量PCR结果显示,pGL3-11 367G的荧光素酶mRNA表达水平显著高于pGL3-11 367C,说明TLR4基因3′UTR的C等位基因可以通过抑制荧光素酶基因的表达而抑制荧光素酶活性。5.创伤病人资料分析结果显示,TLR4基因3′UTR 11 367位点不同基因型间ISS评分无显著性差异,MODS评分存在显著性差异,含G等位基因的个体MODS评分明显高于C等位基因个体;不同基因型脓毒症发生率不尽相同,GG>GC>CC,但无显著性差异;不同基因型与年龄、性别比及ISS评分均不存在线性相关关系,而与MODS评分存在显著的负相关。GR基因Bcl ?位点不同基因型间ISS、MODS评分及脓毒症发生率均无显著性差异。6.激素性高眼压病人资料分析结果显示,GR基因Bcl ?位点的基因型频率在激素性高眼压及对照组间不尽相同(G=0.19和0.22),但无显著性差异。以上结果说明TLR4基因3′UTR 11 367位点是一个具有重要生物学功能的SNP位点,它可能通过转录后抑制影响TLR4蛋白表达,从而影响TLR4介导的LPS信号通路,它可作为严重创伤后脓毒症等炎性相关疾病易感性的一个重要指标;而GR基因的Bcl位点的功能还有待于进一步研究。