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目的在细胞水平,建立以细胞内游离钙离子浓度为检测指标的糖尿病治疗药物筛选模型。在组织水平,建立胰岛素双时相分泌的灌流模型。并以此为基础,探究金丝桃素对胰岛β细胞的潜在作用:对细胞内游离钙离子的作用;在正常培养条件与高糖、高脂损伤模型下,金丝桃素对胰岛β细胞的保护作用;以及金丝桃素对胰岛β细胞分泌功能的影响。方法1.建立β细胞游离钙检测模型:以INS-1细胞为对象,用fura2-AM荧光探针孵育细胞后,在BD-pathway 855高内涵仪器上进行高钾和高糖的实时刺激检测,获得细胞内游离钙离子实时变化曲线;2.建立胰岛灌流实验模型:用剪碎胶原酶消化法获得C57小鼠的胰岛。自制灌流机器,将胰岛装在灌流器的胰岛舱中,低糖(3mM)溶液预灌流30min后进行灌流实验:即低糖溶液灌流1Omin后高糖(33mM)溶液灌流20min,ELISA检测每分钟流出液中胰岛素含量,绘制小鼠胰岛灌流曲线;3.金丝桃素对胰岛β细胞的作用:(1)对胰岛β细胞钙内流的影响:用含20nM、200nM、2μM金丝桃素培养基分别孵育INS-1或RIN-m5f胰岛β细胞,24h后,利用高内涵仪器进行高钾实验,检测细胞内游离钙离子浓度变化;(2)对胰岛β细胞活力的影响:用含20nM、200nM、2μM金丝桃素培养基分别孵育INS-1或RIN-m5f细胞,24h后,MTT法检测细胞活力;(3)高糖毒性保护实验:INS-1或RIN-m5f细胞分别用正常培养基(11mM葡萄糖)、高糖(33mM葡萄糖)、含不同浓度金丝桃素的高糖培养基(金丝桃素浓度分别为20nM、200nM、2μM)培养,72h后,MTT法检测细胞活力;(4)高脂毒性保护实验:INS-1或RIN-m5f细胞分别用含OμM、100μM、200μM、300μM棕榈酸盐(PA)的培养基,同时用含20nM、200nM、2μM金丝桃素的不同浓度PA培养基(100μM、200μM、300μM)培养,72h后,MTT法检测细胞活力;(5)胰岛素分泌实验:分别用OnM、20nM、200nM、2μM的金丝桃素孵育INS-1细胞24h,之后弃去上清,低糖溶液孵育30min后,分别用低糖(3mM)、高钾(30mM)、高糖溶液(33mM)刺激INS-1细胞30min,之后收集上清,ELISA法检测胰岛素含量。结果1.β细胞游离钙浓度检测模型的建立:胰岛β细胞负载fura-2探针后,进行高钾实验,高内涵仪器记录下1.5min内细胞内游离钙离子浓度变化,结果表明:当给予高钾刺激后,380nm荧光强度下降,340nm荧光强度上升,380下降的幅度约为340上升幅度的四倍,340/380比率迅速上升,上升幅度在0.2左右;2.胰岛灌流实验模型的建立:剪碎胶原酶消化方法获得分散较好的较完整胰岛,双硫腙染色呈阳性反应。成功制作出胰岛灌流装置,负载胰岛后,获得胰岛素双时相分泌曲线:当给予高糖刺激后,在1-2min内胰岛素含量迅速上升,胰岛素峰值为基线的1.6倍,之后胰岛素含量迅速下降至1.4倍,并基本维持在该水平;3.金丝桃素抑制胰岛β细胞钙离子内流:20nM、200nM、2μM的金丝桃素在5-10min瞬时作用时间内对细胞内游离钙离子浓度均没有影响。用20nM、200nM、2μM的金丝桃素分别对INS-1细胞进行24h的长时间孵育后进行高钾测试,结果表明:与对照组相比,200nM、2μM金丝桃素显著抑制细胞内钙升高;进一步实验证明金丝桃素对INS-1细胞内钙浓度的抑制作用具有浓度依赖性。利用RIN-m5f细胞重复上述实验,结果表明:20nM、200nM、2μM金丝桃素均显著抑制了高K刺激的细胞内钙的升高;4.金丝桃素增强胰岛β-细胞活力:20nM、200nM、2μM的金丝桃素孵育INS-1细胞,24h后,MTT法检测细胞活力。结果表明:在200nM和2μM两个浓度,金丝桃素可显著增强INS-1细胞的活力,与对照组相比,细胞存活率升高为113%和120%。利用RIN-m5f细胞系重复上述实验证明:2μM的金丝桃素可增强细胞活力,与对照组相比,细胞存活率升高至116%;5.金丝桃素对胰岛β-细胞系的高糖毒性保护作用:将未经金丝桃素处理组细胞的存活率设为100%,INS-1细胞实验结果表明,高糖毒性条件下,细胞存活率降为91%,200nM、2μM的金丝桃素显著促进了细胞的存活,使存活率分别达到103%和110%。利用RIN-m5f进行同样的实验,结果表明:高糖条件显著抑制率细胞活力,细胞存活率降为82%,2μM金丝桃素则可显著促进RIN-m5f细胞的存活,使存活率达到91%;6.金丝桃素对胰岛β细胞系的高脂毒性保护作用:高脂毒性模型采用三个浓度的PA即100μM、200μM、3000μM处理细胞,INS-1细胞的存活率分别降低为对照组的97%、90%、49%,RIN-m5f细胞的存活率分别降低为对照组的93%、79%、46%。当分别经20nM、200nM、2μM的金丝桃素共同处理24h后,细胞的存活率分别出现了上升。应用INS-1细胞的实验结果:当PA为100mM时,20nM、200nM、2μM的金丝桃素分别使细胞活力从97%恢复为116%、106%、135%;当PA为200μM时,20nM、200nM、2μM的金丝桃素分别使细胞活力从90%恢复为 93%、100%、119%;当PA 为 300μM 时,20nM、200nM、2μM 的金丝桃素则均不能发挥保护细胞的作用。应用RIN-m5f细胞的实验结果:当PA为100μM时,200nM、2μM的金丝桃素分别使细胞活力从93%提高为95%、112%;当PA为200mM时,200nM、2μM的金丝桃素分别使细胞活力从79%提高为84%、102%;当PA为300μM时,20nM、200nM、2μM的金丝桃素都不能再发挥提高细胞活力的能力;7.金丝桃素促胰岛β-细胞系胰岛素分泌作用:20nM、200nM、2μM金丝桃素处理INS-1细胞24h后,进行胰岛素分泌实验。低糖自分泌实验结果表明:2μM金丝桃素对胰岛素分泌有抑制作用。高钾刺激实验表明:2μM金丝桃素对高钾促进的胰岛素分泌有抑制作用。高糖刺激实验表明:200nM、2μM金丝桃素对1 ImM和17mM葡萄糖刺激的胰岛素分泌有抑制作用。