论文部分内容阅读
一动物试验研究1目的动物实验以GFP小鼠BMT肾虚流产模型为研究对象,研究补肾健脾法对小鼠模型骨髓、外周血、蜕膜组织中EPCs数目及VEGF表达水平的影响,揭示其促进内皮祖细胞的动员、归巢的作用机制,进一步探讨补肾健脾法防治流产的作用机理,为临床上运用中医药治疗自然流产提供新的依据。2方法实验取造模成功的GFP转基因小鼠骨髓移植(BMT)模型雌性ICR小鼠50只(骨髓细胞可稳定表达绿色荧光蛋白),同种ICR雄性小鼠25只,适应性饲养1周后,每晚按2∶1比例合笼交配,建立正常妊娠模型,以检出阴栓者算为妊娠第0天,妊娠后随机分为5组,每组10只小鼠,分别为对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。以妊娠的第1天开始灌胃干预:模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组在妊娠第1天到第9天灌服羟基脲(450mg/kg.d),在妊娠第10天灌服米非司酮(4.0mg/kg.d)复制肾虚流产模型。对照组、模型组予生理盐水灌胃,中药低、中、高剂量组分别以补肾安胎合剂(3.0g/kg.d、6.0g/kg.d、12.0g/kg.d灌胃15天,末次给药24h后,采血并处死小鼠收取标本组织,采用流式细胞术检测各组骨髓EPCs数量、外周血EPCs细胞数目、EPCs细胞归巢数目,ELISA法检测外周血及蜕膜组织中VEGF的表达水平,并统计各组流产率及胚胎丢失率。3结果3.1 EPCs细胞的流式细胞学检测3.1.1各组孕鼠骨髓EPCs细胞数目(1)各组骨髓内均可见GFP标记的Flk1+/Sca1+双抗阳性表达细胞;(2)与对照组比较,模型组骨髓中EPCs细胞数目减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与模型组比较,补肾安胎冲剂低、中剂量组无明显差异(P>0.05),高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药低、中两组相比EPCs数目无明显差异(P>0.05),中、高两组相比有差异,满足统计学意义(P<0.05)。3.1.2各组孕鼠外周血EPCs细胞数目(1)各组孕鼠外周血均可见GFP标记的Flk1+/Sca1+双抗阳性表达细胞;(2)与对照组比较,模型组外周血中EPCs细胞数目减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与模型组比较,补肾安胎冲剂低、中、高剂量组EPCs细胞数目均上升,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药低、中、高各组EPCs数量差异不明显,无统计学意义(P>0.05)。3.1.3各组孕鼠蜕膜组织EPCs细胞归巢数目(1)各组孕鼠蜕膜组织均可见GFP标记的Flk1+/Sca1+双抗阳性表达细胞;(2)与对照组比较,模型组蜕膜组织中EPCs细胞数目减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与模型组比较,补肾安胎冲剂低、中、高剂量组EPCs细胞水平均升高,有统计学意义(P<0.05)。(4)中药各组EPCs数量由低、中、高逐渐升高,且各组间有差异,满足统计学意义(P<0.05)。3.2各组孕鼠血管内皮生长因子VEGF表达水平检测3.2.1各组孕鼠外周血中VEGF水平(1)与对照组比较,模型组外周血VEGF表达水平下降(P<0.05)。(2)与模型组比较,补肾安胎冲剂低、中、高剂量组外周血VEGF表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)中药各组VEGF水平由低、中、高逐渐升高,且各组间有差异,满足统计学意义(P<0.05)。3.2.2各组孕鼠蜕膜组织中VEGF表达水平(1)与对照组比较,模型组蜕膜组织VEGF表达水平下降(P<0.05)。(2)与模型组比较,补肾安胎冲剂低、中、高剂量组蜕膜组织VEGF表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)中药各组VEGF水平由低、中、高逐渐升高,且各组间有差异,满足统计学意义(P<0.05)。3.3各组孕鼠的流产率及胚胎丢失率(1)各组流产率从对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组逐渐升高。(2)与对照组比较,模型组胚胎丢失率升高(P<0.05)。(3)与模型组比较,补肾安胎冲剂低、中、高剂量组胚胎丢失率均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药各组胚胎丢失率由低、中、高逐渐下降,低剂量组与中剂量组间差异有统计学意义(P<0.05),中剂量组与高剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。4结论4.1与对照组相比,模型组骨髓、外周血、蜕膜组织中EPCs均下降。4.2低、中剂量补肾安胎冲剂对小鼠外周血及蜕膜组织中的EPCs数目影响明显,但对骨髓中EPCs的细胞数目影响不明显,其原因可能是浓度不足难以有效动员骨髓中的相关前体细胞转化为EPCs细胞导致;高剂量补肾安胎冲剂则可明显提高流产小鼠骨髓,外周血,蜕膜中的EPCs细胞数目。4.3补肾安胎冲剂可明显提高流产小鼠外周血及蜕膜中的VEGF的表达水平。4.4补肾安胎冲剂可有效预防胚胎丢失,降低流产率。4.5补肾安胎冲剂可通过促进EPCs的动员及归巢,使其迁移到流产小鼠母胎界面缺血部位,并上调VEGF等因子的表达水平,促进蜕膜血管的生成及微小血供的重铸。进而促进胚胎的发育。4.6本实验研究为临床上用补肾健脾中药防治RSA提供了理论依据,丰富了中医“肾主骨生髓”、“肾主生殖”、自然流产“从脾肾论治”的科学内涵,使中医妇科学的研究延伸至生殖系统之外,上升到细胞学研究层次,进一步丰富了中医“整体观念”的内涵。二临床试验研究1目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)在不同流产患者外周血中的表达水平及相关性及临床意义,以其作为标志物探究补肾安胎冲剂对内皮祖细胞(EPCs)的动员、诱导、归巢至母胎界面促进血管重铸的能力,为研究补肾健脾中药对治疗流产病在细胞生成调控机制方面的作用提供临床数据支持。2方法收集2019年01月至2019年12月在安徽中医药大学第一附属医院妇科门诊就诊的正常妊娠患者30名、先兆流产患者30名,分别抽取正常妊娠患者和先兆流产患者服药前的外周血,并在先兆流产患者服补肾健脾中药保胎治疗14天后再次抽取外周血,Elisa法检测各组患者外周血中EPCs的标志物VEGF、VEGFR-2的表达情况,并计算先兆流产组服药前后中医证候积分和疗效评价,并行统计学分析。3.结果3.1两组患者一般临床特征两组患者年龄,妊娠天数,孕次相比无统计学意义(P>0.05);3.2外周血VEGF、VEGFR-2含量差异:3.2.1与正常妊娠组比较,先兆流产组服药前外周血VEGF、VEGFR-2表达水平下降(P<0.05)。3.2.2先兆流产组服中药14d后外周血VEGF、VEGFR-2水平较未服药时升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.3相关性分析及结果提示,外周血各组中VEGF与VEGFR-2均呈正相关,且先兆流产组服药前后VEGF、VEGFR-2的回归方程类似,说明其受单一因素影响的可能性较大;故以单一细胞因子的水平分别分析先兆流产组服药前后的相关性,显示其相关性强,以上结果P<0.05。3.2.4先兆流产组服药前后肾虚证中医证候积分下降,差异有统计学意义(P<0.05),治疗后总有效率96.67%。4.结论4.1先兆流产患者外周血VEGF、VEGFR-2表达水平降低,说明VEGF和VEGFR-2下降可能与流产的发生有关。4.2先兆流产组患者服中药14d后外周血中VEGF、VEGFR-2的表达水平较未服药时升高,说明补肾健脾中药具有提高相关促进血管发育的细胞因子表达水平的作用。4.3相关性分析及结果提示VEGF、VEGFR-2受到补肾健脾中药同步调控,极有可能是同一组EPCs细胞受动员后的表现,间接反映了补肾健脾中药有促进EPCs细胞动员到外周血中的作用。结合试验组的先期研究,说明补肾健脾法防治自然流产的原理可能是其具有动员EPCs迁移至母胎界面缺血部位,修复损伤血供,改善微循环的作用。4.4从先兆流产患者服药前后中医证候积分的变化,说明补肾安胎冲剂能有效降低肾虚证评分,改善流产症状,为补肾健脾法治疗肾虚型先兆流产提供了有力的临床依据。