【摘 要】
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人脐带间充质干细胞（h UC-MSCs）在组织再生和移植领域具有广阔的应用前景,作为再生医学中重要的种子细胞,研究外源物质对其增殖活性与成骨分化能力的影响具有重要研究意义。现阶段已经有研究证明,部分天然化合物可以影响干细胞活力及其分化。本论文的主要目的是研究黄酮类化合物及红曲菌发酵产物粗提物对h UC-MSCs增殖活性及成骨分化能力的影响。首先研究了四种结构相似的黄酮:GST、DAI、BAI、GI
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人脐带间充质干细胞（h UC-MSCs）在组织再生和移植领域具有广阔的应用前景,作为再生医学中重要的种子细胞,研究外源物质对其增殖活性与成骨分化能力的影响具有重要研究意义。现阶段已经有研究证明,部分天然化合物可以影响干细胞活力及其分化。本论文的主要目的是研究黄酮类化合物及红曲菌发酵产物粗提物对h UC-MSCs增殖活性及成骨分化能力的影响。首先研究了四种结构相似的黄酮:GST、DAI、BAI、GIN对h UC-MSCs增殖活性的影响;通过CCK-8检测结果选择促进增殖效果最佳的GST,研究其对h UC-MSCs成骨分化的影响;同时研究了红曲菌发酵代谢产物对h UC-MSCs增殖与成骨分化的影响。最后将红曲菌发酵产物粗提物添加到h UC-MSCs培养基中,设计了干细胞冻干粉制剂的工艺流程以及工厂建设。主要研究结果如下:1.利用CCK-8法检测GST、DAI、BAI、GIN对h UC-MSCs活力的影响。结果显示:GST（0.7μM-14μM）和DAI（0.8μM-16μM）可以显著促进h UCMSCs增殖,作用36 h后,分别在0.7μM和16μM浓度下达到最佳作用效果,增殖率分别为426%,330%,与对照组相比具有极显著性差异（P<0.01）。BAI（0.028μM-3.5μM）和GIN（0.09μM-4.6μM）也可显著促进h UC-MSCs增殖（P<0.01）,但作用效果弱于GST,故选择0.7μM GST作用36 h作为最佳作用条件,利用QPCR检测GST对增殖通路PI3K/Akt中的相关基因的影响,结果表明,GST可以上调增殖通路PI3K/Akt通路中相关基因PI3K和Akt m RNA表达水平,与对照组相比具有极显著性差异（P<0.01）。通过WB法检测通路中相关蛋白Akt,P-Akt的表达,结果表明,GST可以上调P-Akt蛋白的表达。2.研究GST（0.07μM-7μM）对h UC-MSCs成骨分化的影响。成骨分化早期ALP活性检测结果表明:诱导14 d,GST各浓度组可以增强ALP活性,具有浓度依赖性,与对照组相比具有极显著性差异（P<0.01）。诱导28 d,成骨分化晚期钙离子含量检测结果表明:钙离子含量随着药物浓度升高而增加。0.7μM,7μM浓度组与对照组相比具有极显著性差异（P<0.01）。茜素红S染液染色结果表明:染色面积随着GST浓度升高而增加且着色程度也随之加深。对倒置显微镜（×100）下随机选取的视野中观察到的矿化结节数进行定量分析,发现矿化结节数随着GST浓度升高而增加。根据上述成骨基础指标选择最佳作用浓度7μM,利用QPCR研究其对成骨分化相关基因的影响,结果表明,诱导14 d,成骨相关基因Runx2、OCN、OPN、ALP、OSX m RNA均表达上调,与对照组相比具有显著性差异（P<0.01）。推测GST可能通过上调成骨相关基因的表达来促进h UC-MSCs的成骨分化。3.分别利用DMSO和乙醇作为提取溶剂,得到红曲菌发酵产物粗提物,CCK-8检测其对h UC-MSCs增殖活性的影响,结果表明利用DMSO作为溶剂得到的药物组作用效果优于乙醇药物组,故选择DMSO作为载体溶液。作用36 h后,添加GST共发酵组与空白发酵组最佳作用浓度分别为220+μg/m L和3.5μg/m L,对h UC-MSCs增殖活性分别为230%、314%,与对照组相比具有极显著性差异（P<0.01）。ALP活性检测结果显示:红曲菌发酵代谢产物可以增强h UC-MSCs成骨分化过程中ALP活性,且呈浓度依赖性,在高浓度组220+μg/m L,220μg/m L作用下,ALP活性分别为21.19金氏单位/gprot,19.97金氏单位/gprot,与对照组相比具有显著性差异（P<0.05）。且共发酵代谢产物各浓度组ALP活性均高于空白发酵组对应相同浓度。4.对以干细胞冻干粉为主要成分的生物制剂的工厂进行设计,确定了年产20000盒干细胞冻干粉制剂的设备选型、工艺流程以及厂区建设等环节。经估算得出,年利润可以达到4460万元,并且在1.1年之后可收回成本。
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