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背景及目的:弥漫性特发性骨肥厚症(Diffuse Idiopathic Skeletal Hyperostosis,DISH),也称为弥漫性特发性骨肥大,是一类肌腱附着点炎及相应的韧带出现骨化、钙化及在骨骼附着部有新骨形成为主要表现的骨病,主要涉及的多发部位包括脊柱、骨盆,另外常常侵犯跟骨、髌骨等处。DISH的诊断目前仍为影像学诊断,虽然由于不同作者根据不同的的骨桥形成情况而纳入的标准不同,其报道的患病率也各不相同,但总体发病率均随着年龄的增长而持续性地增高。由于本病的发病机制目前尚不明确,因此本病的诊断手段仍然停留在影像学检查这一单一方式上,但DISH早期的影像学表现有可能并不突出,未必能够引起足够的重视从而造成漏诊。本研究是通过差异蛋白质组学的方法,采用蛋白标签定量技术(Tandem Mass Tag,TMT)、联合液相色谱串联质谱(Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析,对DISH患者的血清中存在的相对于正常人的差异表达蛋白质进行筛选和鉴定,结合蛋白质功能的生物信息网络等研究成果,对所鉴定的蛋白质在DISH发生发展中的作用进行分析研究。以期寻找DISH发生、发展过程中出现的特异差异蛋白,为临床筛查和诊断DISH提供某种血清蛋白标记物,并为进一步研究DISH的发病机理、寻找诊断及药物治疗靶点、疾病预后判断甚至易感人群的判定等提供研究基础。方法:1)根据特异度较高的Resnick关于DISH的诊断标准,采集10例弥漫性特发性骨肥厚症(DISH)患者,以及10例年龄相近、性别匹配的正常人(经影像学检查排除DISH等异常骨质增生的情况)的空腹静脉血。经低温离心后获取血清分装标识,并于-80℃条件保存。所有血清经过去除高峰度蛋白后进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳),然后进行蛋白胶内酶解,用胰蛋白酶(Trypsin)消化蛋白得到肽段。用TMT进行标记,TMT6-127用于标记对照组,TMT6-131用于标记DISH组。将标记好的肽段混合后经过除盐除杂质处理,通过Dionex Ultimate 3000纳升液相色谱仪联合Q-Exactive质谱仪进行LC-MS/MS检测分析。数据用Xcalibur 2.1.2 software进行分析。搜库软件为Proteome Discoverer,采用SEQUEST HT检索算法,谱图检索Swissprot Human数据库。根据不同TMT试剂报告离子的相对丰度来进行肽段相对定量,并根据肽段相对定量结果统计出蛋白的相对定量结果。同一蛋白在某一组相对于另一组的比值(Ratio),认为确定比值变化超过1.3倍,即大于1.3为上调,小于0.75为下调,被认为有显著性差异,而其它肽段离子用来做蛋白鉴定。2)将鉴定出的所有差异蛋白进行生物信息学分析,预测差异蛋白在生物网络中的关系,进一步筛选认为有意义的蛋白。结果:共找到425个蛋白,score大于5的有253个,有定量信息的蛋白185个,其中,上调大于1.3倍的17个,下调小于0.75倍的56个;score大于5分并且没有定量信息的蛋白有68个,发现其中Ig alpha-2 chain C region和Isoform H14of Myeloperoxidase(MPO)这两个蛋白只在DISH病人血清中存在。对能够定量的蛋白进行生信分析,发现在下调蛋白中有15个蛋白都参与到对刺激的响应中,包括extracellular superoxide dismutase[Cu-Zn](细胞外过氧化物歧化酶)和蛋白glutathione peroxidase(谷胱甘肽过氧化物酶,GPx3)。在下调蛋白中,通过KEGG信号通路分析,可以看到参与PPAR信号通路的三个蛋白PLTP、APO-AI和APO-AII都有明显的下调。通过生物信息学分析推断认为DISH患者可能参与脂蛋白代谢的PPAR通路受到影响,从而导致了处于该通路上下游的MPO、PLTP、APO-AI和APO-AII出现变化。结论:1、本研究是首次采用串联质谱标签蛋白定量技术、联合液相色谱串联质谱分析,对DISH患者的血清进行差异蛋白质组学研究。摸索并确立了DISH患者血清TMT-LC-MS/MS实验研究的技术路线。2、对DISH的特异血清标记物和发病机制进行了初步的探索,建立了DISH患者的血清差异蛋白质组资料库。发现了DISH患者血清中相对于正常人具有显著变化的可定量蛋白、以及几种DISH患者血清中独有的无定量信息蛋白。3、通过本次研究,我们在通过蛋白质组学研究的基础上对所筛选的蛋白进行生物信息学分析,通过分析在同一信号通路中出现的多种特异蛋白,找到了一些潜在的DISH的生物标记物,并通过生物信息学分析,初步判断DISH疾病可能和PPAR及Wnt信号通路相关,为进一步深入研究打下基础。