核爆炸、核恐怖袭击以及核反应堆事故等均会产生大剂量的电离辐射,涉核人员不可避免的会受到电离辐射的损伤,因此导致的急性放射病如骨髓型急性放射病、肠型急性放射病等均严重威胁患者的生命安全。小肠作为辐射损伤最敏感的器官之一,其在辐射事件后会发生肠道细胞的大量死亡,并导致小肠绒毛的缺失、肠道完整性的破坏等,然而现有的医学手段对于辐射剂量大于8 Gy的重度骨髓型放射病以及肠型放射病尚无成功的治疗案例,其主要原因是存在严重的肠道辐射损伤,开发高效低毒的肠道辐射损伤防治药物以及探索其潜在的机制有着重要的军事和临床意义。而小肠隐窝作为小肠干细胞的龛,其是小肠细胞再生的来源,辐射损伤后小肠干细胞会大量缺失,这严重影响肠道细胞的更新,因此,对小肠隐窝细胞增殖以及辐射损伤后再生的作用机制研究有利于解决肠型放射病治疗的难题。Toll样受体(TLR)是一类病原相关的模式识别受体,研究发现,多种类型的TLR受体激动剂有着显著的辐射防护效果。本教研室对多种TLR受体激动剂进行了研究,经过多年的努力,筛选出具有优良辐射防护效果的TLR4受体激动剂脂多糖(LPS)和单磷酰脂质A(MPLA),前期实验结果显示LPS和MPLA均能显著提高辐射损伤后动物的存活率,并且能减轻辐射导致的肠道损伤,然而LPS和MPLA对于肠道辐射损伤防护的作用机制尚不明确。本课题从小肠隐窝细胞增殖再生的角度出发,探索TLR4激动剂LPS和MPLA介导小肠隐窝细胞增殖以及辐射损伤后再生的作用和调控机制。免疫荧光实验结果显示TLR4受体主要分布在小肠隐窝部,这提示TLR4激动剂能调控小肠干细胞的生命活动;通过构建小肠类器官模型以及使用小鼠体内模型,我们发现LPS和MPLA刺激能在体内和体外促进小肠隐窝细胞的增殖;LPS和MPLA对小肠类器官、小肠隐窝细胞的增殖作用依赖TLR4受体;提取小鼠小肠隐窝接种在基质胶上后给予电离辐射或给予小鼠大剂量的全身照射以造成其肠道损伤,结合小肠组织Olfm4免疫组织化学染色,我们发现辐射损伤后给予LPS或MPLA刺激能促进小肠类器官及小肠隐窝干细胞的再生。为了探索TLR4激动剂调控小肠隐窝细胞增殖以及辐射损伤后再生的作用机制,我们给予小鼠腹腔局部照射并提取隐窝细胞的RNA,通过转录组测序考察肠道损伤后小肠隐窝细胞相关信号通路的变化以及辐射后给予MPLA刺激对这些通路的影响。实验结果显示,腹腔局部照射后导致小肠隐窝中活跃型干细胞的生物标志物Lgr5、Olfm4显著下调,而静息干细胞的标志物Clu、Bmi1显著上调,辐射后给予MPLA刺激能促进Lgr5的显著上调;对信号通路的研究发现,肠道辐射损伤后Wnt信号通路、Notch信号通路、Hippo信号通路、Hedgehog信号通路以及SOX9、c-Myc、MSI等维持小肠干细胞正常生命活动的基因被明显的抑制,而辐射后给予MPLA刺激,这些信号通路和基因又被显著的激活;肠道辐射损伤还导致了凋亡、坏死、铁死亡、RNA和氨基酸降解等相关的信号通路显著激活,而辐射后给予MPLA刺激能显著抑制这些信号通路。这均提示MPLA能促进辐射损伤后小肠干细胞的再生并且抑制辐射导致的小肠隐窝细胞坏死、凋亡以及活性分子的降解。进一步的,我们通过提取小肠类器官和小肠隐窝细胞的蛋白,通过蛋白免疫印迹实验并结合小肠组织免疫荧光实验,验证了TLR4激动剂LPS或MPLA刺激后能显著激活Wnt和Notch信号通路,并上调c-Myc、MSI2、SOX9和YAP1蛋白,该激活和上调作用依赖TLR4受体。使用Wnt信号通路、Notch信号通路、c-Myc蛋白特异性的抑制剂,并构建腺相关病毒(AAV)特异性的敲低小肠中MSI2、SOX9、YAP1基因并抑制其表达,结合小肠类器官EDU免疫荧光染色以及小肠组织BRDU免疫组化染色,发现LPS和MPLA对小肠隐窝细胞增殖及辐射损伤后再生的促进作用依赖Wnt、Notch信号通路以及c-Myc、MSI2、SOX9、YAP1蛋白。通过构建慢病毒(lentivirus)对小肠类器官MSI2、SOX9和YAP1进行敲低并抑制其表达、使用AAV敲低小鼠体内相关基因,结合蛋白免疫印迹和小肠组织免疫荧光实验,我们发现LPS和MPLA刺激后能激活小肠类器官以及小肠隐窝细胞中c-Myc-MSI2-SOX9-YAP1信号通路。为了研究LPS或MPLA刺激后小肠隐窝细胞中相关蛋白的相互作用关系,我们首先构建人小肠类器官,通过免疫共沉淀实验(Co-IP)发现LPS和MPLA刺激后能促进My D88和Trif募集c-Myc、MSI2、SOX9、YAP1等蛋白;使用AAV对小肠MSI2、SOX9、YAP1进行敲低并抑制其表达,结合Co-IP实验,我们发现LPS和MPLA对于小肠隐窝细胞的调控存在不同的蛋白募集模式:MSI2、SOX9和YAP1对于MPLA刺激小肠隐窝细胞后相关蛋白的募集更加重要,而缺乏MSI2蛋白后My D88蛋白不能募集β-catenin、SOX9、YAP1、c-Myc蛋白。LPS和MPLA刺激后还能增强小肠隐窝中MSI2、SOX9、YAP1蛋白间的相互作用,并且促进MSI2、SOX9、YAP1蛋白与β-catenin、c-Myc蛋白的结合;使用AAV敲低小肠中MSI2、SOX9、YAP1基因,发现该促进作用依赖于MSI2、SOX9和YAP1首先形成复合物,而MSI2、SOX9和YAP1形成复合物的过程主要表现为MSI2对SOX9、YAP1蛋白的募集,该募集作用需要SOX9和YAP1提前形成复合物。综上所述,我们的研究发现TLR4激动剂LPS和MPLA能促进小肠隐窝细胞增殖以及辐射损伤后的再生,该促进作用依赖Wnt、Notch信号通路以及c-Myc、MSI2、SOX9、YAP1蛋白;我们的研究还证实了LPS和MPLA能激活小肠隐窝中的c-MycMSI2-SOX9-YAP1这条新的信号通路,并且对LPS或MPLA刺激后小肠隐窝细胞中相关分子的相互作用模式进行了探索,明确了小肠隐窝细胞增殖和再生过程中My D88与Trif对相关蛋白的募集存在不同的模式,而TLR4激动剂LPS和MPLA对于小肠隐窝细胞的调控也存在不同的蛋白募集模式。