论文部分内容阅读
羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)属于痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)中的副痘病毒属(Parapoxvirus),是非整合宿主染色体,在胞浆内复制的有囊膜的双链DNA核酸病毒,其碱基数可达到134-139kb,GC含量高达64%,中间区域高度保守,为病毒复制的必须基因,末端为反向重复的碱基序列,为一般致病性、毒力、嗜宿主和组织的功能基因。ORFV宿主范围窄,主要感染绵羊和山羊,有时也会感染驯鹿、麝香牛,甚至人类。其主要通过接触破损的皮肤传播,引起口唇、鼻孔、眼部及乳房周围皮肤的化脓性感染,偶尔也会引起其他器官如胃、肠、呼吸道的感染,但是具有自限性,不会引起全身性病毒播散,总体致死率非常低。但是妊娠的母羊、年幼或者免疫缺陷的羔羊若患此病,其致死率非常高,可以达到80%以上。传统的羊口疮病毒疫苗主要以灭活疫苗或弱毒疫苗为主,但灭活疫苗通常不能有效激活细胞免疫,而弱毒活疫苗则存在非疫区扩散风险,因此限制了其运用。利用基因工程技术敲除ORFV的相关毒力基因可获得减毒的活病毒疫苗,成为羊口疮病毒疫苗研究新热点。羊口疮病毒编码血管内皮生长因子基因(Vascular endothelial growth factor, VEGF),该基因编码的VEGF蛋白与哺乳动物表达的VEGF具有高度的同源性,可以与血管内皮生长因子受体2(KDR)结合,调节血管生成,促进血管内皮细胞增殖,增加血管通透性,引起充血水肿的炎症反应,是其主要的致病性基因。病毒的VEGF分子可使感染后期易于形成结痂,而较多的结痂有助于病毒长期存活。利用基因工程技术去除该致病性基因得到的ORFV突变体也许能成为新型的减毒活病毒疫苗候选物。另外,ORFV是一种潜在的溶瘤病毒,Rintoul等通过实验发现,ORFV不易在正常人体组织复制,但是在肿瘤组织却有强大的复制功能,并且在肺癌模型上取得了显著的治疗效果。除此之外,国外已有相关文献报导,羊口疮病毒VEGF基因的位置非常适合表达外源抗原,并利用减毒的羊口疮病毒D1701-V为载体成功表达了针对疱疹病毒、兔出血热疾病病毒、狂犬病病毒、甲型流感病毒H5N1和H1N1的疫苗候选物,其免疫保护作用持久稳定,不需要佐剂即能强力诱导Thl-Th2平衡的先天免疫和获得性免疫反应。短期的ORFV感染不能诱导特异性中和抗体的产生,因此可以使用同一或不同的该病毒重组体反复接种免疫。而且ORFV只在胞浆中复制,不会插入宿主细胞染色体引起基因突变,安全性较高,可能成为未来理想的克隆表达载体。截止目前为止,除了新西兰株羊口疮病毒NZ2进行了详细的全基因遗传结构功能分析外,美国株IA82,德国株D1701以及中国株NA1/11也进行了基因序列分析比较。中国株NA1/11为中国吉林省一次爆发的羊痘疮疾病分离所得,其132基因编码血管内皮生长因子VEGF。本次实验中,我们利用同源重组的方法敲除羊口疮病毒株NA1/11的132基因,通过绿色荧光标记蛋白快速筛选出减毒的重组羊口疮病毒NA1/11△132,并通过体外实验,初步证明132基因为羊口疮病毒NA1/11生长复制的非必需基因,且外源基因GFP的插入并不会影响病毒体外的感染复制特性,但132基因的敲除可以使ORFV减少VEGF的分泌,减轻了病毒的毒力。利用已构建的快速病毒基因敲除方法,我们以手足口病EV71 VP1基因替换了羊口疮病毒NA1/11的132基因,通过绿色荧光信号成功获得纯化的重组羊口疮病毒突变株,命名为NA1/11-VP1,以期构建手足口病的疫苗候选物。研究内容包含两个部分：第一部分：快速筛选重组羊口疮病毒NAl/11∧132绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。GFP作为一种报告分子,广泛运用于细菌、植物甚至人类等研究,在蛋白表达检测、蛋白和细胞荧光示踪、蛋白质的结构及功能的研究中具有重要意义。传统重组病毒的筛选主要通过新霉素抵抗和p-葡萄糖醛酸苷酶(neomycinresistance and β-glucuronidase, neo/gus)蓝白斑筛选,该方法不易把握,操作麻烦,且耗时长。为了更简单,快速筛选出减毒的重组羊口疮病毒,在本研究中,我们在具有绿色荧光蛋白GFP标签的pSPV-EGFP质粒上插入了羊口疮病毒NAl/11的132基因左右同源臂,经酶切、PCR及测序鉴定,命名为pSPV-132L-EGFP-132R。然后将该穿梭质粒通过脂质体法转染感染了NA1/11的羊胚胎鼻甲骨细胞(Primary ovine fetal turbinate, OFTu),经过2轮96微孔板稀释和3轮六孔板蚀斑纯化实验后,将筛选出来的病毒扩大培养,36小时后,在倒置荧光显微镜下,可以观察到视野中有大量荧光信号,提取病毒核酸经PCR验证,羊口疮病毒的132基因已敲除并且检测到了GFP基因,将缺失132基因的羊口疮病毒命名为NA1/11△132,并经病毒滴定、体外血管内皮细胞增殖实验以检测132基因缺失后的功能影响。第二部分：构建表达EV71 VP1蛋白的重组羊口疮病毒NA1/11-VP1国外相关实验研究发现ORFV的VEGF基因位置非常适合插入外源抗原。本次实验希望以羊口疮病毒NA1/11为表达载体,通过同源重组的方法构建表达肠道病毒71型VP1蛋白的重组羊口疮病毒NA1/11-VP1。本实验首先抽提手足口病EV71的RNA,扩增EV71的VP1全基因,并扩增质粒pCMVTAG4a早期启动子CMV,按照先后顺序插入质粒pSPV-132L-EGFP-132R中构建重组质粒pSPV-EGFP/VPl;转染OFTu细胞,与羊口疮病毒NA1/11同源重组,通过荧光信号纯化重组羊口疮病毒NA1/11-VP1,抽提重组羊口疮病毒核酸,进行PCR、测序验证EV71 VP1基因的存在以及132基因的缺失,并且经过间接免疫荧光以及免疫印迹实验检测手足口病EV71 VP1蛋白的表达情况。实验结果发现,在羊口疮病毒NA1/11的VEGF基因位置的GFP蛋白成功表达,可以检测到绿色荧光信号,但是同样插在VEGF基因位置上的EV71 VP1基因却没有表达,使用EV71 VP1单抗和多抗均无法检测到VP1蛋白。小结：根据以上两个部分的研究,本研究小结如下：1、利用GFP作为报导基因成功筛选出减毒的重组羊口疮病毒NA1/11△132,其132基因的敲除以及GFP基因的存在已经通过PCR和基因测序验证。2、本次实验证实以绿色荧光蛋白为报导基因的重组病毒筛选方法具有以下优点：直观：通过荧光信号即可以判断同源重组效率的高低,为进行下一轮筛选实验提供参考依据,比传统方法更直观,操作性更强；快速：重组病毒的筛选时间短,蚀斑筛选时间不超过15天,而传统的蚀斑筛选方法需要3-4个月的时间；廉价：不需要借助贵重仪器即可分离重组病毒。虽然以GFP为报导基因,借助流式细胞分选仪,可以快速分选出重组病毒,但是流式细胞分选仪价格昂贵,而且病毒分选存在污染问题,因此不易推广使用；科学：利用荧光信号进行蚀斑筛选不需要添加抗生素和反应底物,比传统方法更科学,更经济。3、通过体外实验,初步证明132基因为ORFV生长复制的非必需基因,且外源基因GFP的插入并不会影响病毒感染复制特性,但132基因的敲除可以使病毒减少VEGF的分泌,减轻了病毒的毒力。4、羊口疮病毒的VEGF基因位置适合表达外源抗原蛋白,但是同一基因位点的表达不能采用双启动子,不能同时启动两种不同的外源蛋白表达,避免其中一个启动子不工作；5、在同一基因位点同时表达EV71 VP1和GFP蛋白,GFP蛋白的空间构象可能影响了EV71 VP1蛋白的检测,使得间接免疫荧光和免疫印迹实验无法捕获到相应的抗原位点；6、理论上,在羊口疮病毒NA1/11的132基因位点所表达的EV71 VP1蛋白应以一种分泌蛋白的形式出现,但不排除形成病毒包涵体,影响了蛋白的检测。