肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，居我国恶性肿瘤死亡率的第二位。手术切除与肝移植是两种有希望治愈HCC的手段，但由于大多数病人就诊时肿瘤已非早期、合并肝硬化、肿瘤多结节和/或毗邻大血管等原因，手术切除率仅20～30﹪，而且术后2年复发率高达30～50﹪，5年高达70～80﹪，再手术切除率亦只有10～20﹪。肝移植也由于供体短缺、费用高昂、适应症有限而无法使广大患者受益。 近20多年来多种非手术治疗方法，包括经肝动脉栓塞化疗、瘤内无水酒精注射、微波或射频消融等已被广泛应用于治疗HCC并取得了一定的疗效。但是，由于肿瘤的高复发和转移的倾向性，远期疗效尚欠满意。因此，积极探索新的HCC治疗手段具有极其重要的临床意义。 近年来，随着人们对肿瘤分子生物学、免疫学认识的不断深入，免疫基因治疗在肿瘤治疗中的潜在作用与价值正逐渐为人们所认识并得到重视，并很快成为肿瘤治疗领域的研究热点。 TNFSF/TNFRSF(tumor necrosis factor superfamily/tumor necrosis factorreceptors superfamilyl)是一组具有多种功能的细胞因子超家族。其成员能够诱导多种生物学作用，包括调节细胞的生长、分化、死亡，协调淋巴组织的发生、发展，维持其自稳态、活化抗肿瘤免疫、调节炎症和抗感染反应等。由于其在免疫方面的活跃性，近年来利用该家族成员进行抗肿瘤免疫治疗的研究不计其数，包括TRAIL/TRAIL-R、CD40L/CD40、OX40L/OX40、4-1BBL/4-1BB、CD30L/CD30等等。该家族成员的抗肿瘤活性主要是通过两条通路来实现的：直接杀伤，即TNFSF/TNFRSF结合后，TNFRSF成员的死亡结构域活化Fas信号通路，诱导肿瘤细胞调亡；间接杀伤，即通过肿瘤细胞表面的TNFSF与T淋巴细胞表面的TNFRSF结合，提供共刺激信号，诱导特异性肿瘤免疫反应，由活化的CD8+T淋巴细胞间接杀伤肿瘤。由于后者的有效性和对正常组织的低毒性，获得了肿瘤学者的青睐。而寻找能诱导高特异性肿瘤免疫、低正常组织损害性的TNFSF/TNFRSF，是研究者的主要目标。 UGHT基因正是这样的TNFSF新成员之一，首先由Mauri等在1998年发现，人源LIGHT(hLIGHT)是一个含有240个氨基酸残基的Ⅱ型膜蛋白，分子量为29kD。鼠源LIGHT(mLIGHT)是239个氨基酸残基形成的蛋白，分子量为26.34kD，其氨基酸序列与hLIGHT的同源性为77﹪。LIGHT只在活化的淋巴细胞、NK细胞、未成熟DC上表达，能阻断HVEM依赖的HSV感染，通过CD28非依赖途径共刺激T淋巴细胞增殖、活化、杀伤，介导肿瘤免疫，促进免疫系统的发育、胸腺阴性选择和系统自稳，影响自身免疫病，同种异体移植排斥反应，以及移植物抗宿主病。LIGHT诱导的抗肿瘤免疫主要与其两种膜受体HVEM及LTβR有关：LIGHT与淋巴细胞表面的HVEM结合能产生刺激细胞增殖和抗调亡的信号，并诱导淋巴细胞产生细胞因子；表达于肿瘤细胞表面的LIGHT尚能起到共刺激因子的作用，有助于活化CD8+淋巴细胞；LIGHT与肿瘤间质细胞表达的LTBR结合能够刺激间质细胞释放一系列趋化因子(chemokmes)，后者能趋化CD8+细胞进入肿瘤组织，杀灭肿瘤细胞。 目前已有实验研究表明，LIGHT基因转染肥大细胞瘤P815细胞、纤维肉瘤Ag104H细胞可在体内诱导特异性抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长。本研究拟通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下将基因工程技术构建的真核表达载体pmLIGHT转染入小鼠肝癌细胞系Hepa-1.6中，通过G418筛选和有限稀释法挑选单克隆稳定转染株，检测Hepa-LGH、转染空质粒pcDNA3.1(+)的Hepa-NEO细胞株以及野生型Hepal-6细胞系的mLIGHT表达情况；观察mLJGHT在体外对细胞生长增殖的影响；建立C57BL/6小鼠：Hepa1-6皮下肝癌模型，探讨mLIGHT在体内抗肿瘤效应。 第一部分利用基因转染建立稳定表达mLIGHT的Hepa1-6细胞株. 方法:1．细胞培养Hepa1-6细胞复苏后以含20﹪胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺的高糖DMEM完全培养基常规传代培养。 2．真核表达载体的转染、G418筛选及挑选单克隆稳定转染株按说明书指引使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导将mLIGHT表达载体质粒prnI,IGHT(由导师殷晓煜教授在美国Pittsburgh大学肿瘤外科构建)和空载体质粒pcDNA3.1(+)转染Hepa1-6细胞。转染48小时后，采用梯度渐增的含G418完全DMEM培养基对转染细胞进行筛选。维持最适筛选浓度2周后用有限稀释法挑选并扩增单克隆细胞株。 3．RT-PCR法检测各组细胞mLIGHT表达的检测TRIzol法提取细胞总RNA，样品进行紫外分光光度仪检测及1﹪甲醛变性胶电泳检测判断产量及质量。RT-PCR检测mLIGHT表达。 结论:使用Lipofectamine 2000阳离子脂质体进行真核细胞载体的转染可以得到满意的转染效果。通过G418筛选及有限稀释法挑选单克隆，可以建立pmLIGHT重组质粒稳定转染的小鼠肝细胞性肝癌细胞株。转染了pmLIGHT的小鼠Hepa1-6细胞株可以稳定表达mLIGHT，转染空质粒pcDNA3.1(+)及未转染质粒的Hepa1-6野生型细胞均不表达mLIGHT。 第二部分mLIGHT对小鼠肝细胞性肝癌细胞生长增殖影响的体外实验 方法:1．分组： 挑选一稳定表达mLIGHT的pmLIGHT转染株(设定为Hepa-LGH)进行以下实验；挑选一不表达mLIGHT的pcDNA3.1转染株(设定为Hepa-NEO)为阴性对照；以未转染的Hepa1-6为空白对照组。 2．观察细胞形态使用光学显微镜观察各组细胞形态。 3．绘制细胞生长曲线24孔板每孔加入1×10<4>个细胞，接种细胞后每24小时、每组各取3孔细胞计数，取平均值为当日细胞数，连续7天，绘制三组细胞的生长曲线，比较3组细胞的生长速度。使用单因素方差分析比较各组间的细胞数均值差异是否有统计学意义。 结论: 在正常营养条件下体外培养，mLIGHT不影响稳定转染细胞株的生长形态，不影响其增殖。 第三部分 mLIGHT对小鼠肝细胞性肝癌生长影响的体内实验. 方法:1．实验动物分组30只SPF级6～8周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为三组，每组10只，实验组接种：Hepa-LGH，阴性对照组接种Hepa-NEO，空白对照组接种Hepa 1．6。 2．动物模型的建立常规培养细胞数量足够并生长至对数期时，收集细胞镜下计数，PBS重悬细胞制备单细胞悬液，使活细胞浓度为2.3×10<7>/ml。每只C57BL/6小鼠以0.15ml(即3.5×10<6>个细胞)接种于右侧背部皮下。 3．实验观察 观察肿瘤形成情况；接种后第10天开始隔天测量肿瘤体积，并绘制各组肿瘤生长曲线。肿瘤体积(mm<3>)以公式0.52×a×b<2>计算，a(mm)为肿瘤长径，b(mm)为肿瘤短径；记录生存时间，比较三组荷瘤小鼠的生存期。 结论:mLIGHT基因转染肝细胞性肝癌细胞能显著抑制肿瘤细胞在体内的生长、延长荷瘤小鼠的生存期，可望成为一条有价值的HCC治疗途径。