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真核翻译起始因子 4E(Eukaryotie translation initiation factor 4E,eIF4E)不仅参与细胞内蛋白质的翻译起始,并且它与病毒基因组连接蛋白(Virusgenomelinked protein,VPg)互相作用是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)侵染复制、翻译所必需的,目前发现的植物隐性抗病基因大部分都是eIF4E家族的等位基因。利用转录起始因子eIF4E类蛋白等寄主因子作为抗病毒靶标,进行抗病毒育种具有广阔运用前景。属于Potyviridae的木薯褐色条斑病毒(Cassavabrown streak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Ugandan cassava brown sreak virus,UCBSV)对木薯生产造成严重危害,目前尚无有效防治方法,特别是缺乏CBSV抗性育种材料。本研究以CBSV/UCBSV的寄主植物本生烟(Nicotiana benthamiana)为实验材料,克隆其eIF4E家族的8个基因,并利用LexA-Y2H酵母双杂交系统和荧光双分子BiFC技术筛选与CBSV/UCBSV-VPg互作的eIF4E,使用CRISPR-Cas9基因编辑技术对互作的eIF4E基因进行编辑。为研究阻断CBSV/UCBSV-VPg与eIF4E的相互作用是否导致病毒无法复制繁殖,而使eIF4E基因被编辑的本生烟获得CBSV/UCBSV抗性,探索通过基因编辑寄主因子进行木薯抗CBSV/UCBSV分子育种奠定基础。具体结果如下:(1)利用生物信息学技术和RT-PCR方法克隆获得了 8个本生烟eIF4E家族基因的 ORF,分别售命名为 NbE1、Nb4E2、Nb4E3-1、Nb4E3-2、Nb4E4-1、Nb4E4-2、Nb4E5、Nb4E6。氨基酸比对分析表明,8个eIF4E蛋白分为3组:Nb4E1、Nb4E2、Nb4E4-1、Nb4E4-2、Nb4E6 属于 eIF4E 蛋白,Nb4E3-1、Nb4E3-2 属于 eIF(iso)4E 异构体蛋白、Nb4E5属于帽子结合蛋白nCBP类。(2)利用LexA-Y2H系统分别构建了含CBSV-VPg、UCBSV-VVPg的激活域载体和含8个eIF4E基因的诱饵载体,进行自激活和毒性检测,结果均没有毒性和自激活。将重组载体转入酵母菌株EGY48,通过营养缺陷型及X-半乳糖苷酶进行筛选,结果表明:Nb4E3-2 与 CBSV-VPg、UCBSV-VPg 均有互作,其他 7 个 eIF4E 蛋白与 CBSV-VPg、UCBSV-VPg均不互作。(3)分别构建了 YC1-Nb4E3-1、YC1-Nb4E3-2、YN1-VPg、YN1-UVPg 荧光双分子重组表达载体,转入农杆菌细胞后在本生烟中进行瞬时表达,激光共聚焦显微镜显示到CBSV-VPg或UCBSV-VPg与Nb4E3-2共同注射能恢复荧光,而与Nb4E3-1共同注射时没有荧光,进一步验证了 Nb4E3-2与CBSV-VPg、UCBSV-VPg之间的互作。(4)基于 CRISPR-Cas9技术设计并构建了靶标Nb4E3-2的基因编辑载体pHSE-Nbiso4E-glg2,通过农杆菌介导法转化本生烟。对27株转基因植株的Nb4E3-2基因进行PCR扩增产物及测序分析,发现6株发生了不同突变类型的基因编辑,有待后续进一步检测分析和抗病毒接种实验。本研究结果为进一步编辑本生烟eIF4E类因子获得CBSV/UCBSV的抗病性研究提供理论基础,也为探索通过基因编辑eIF4E进行木薯抗CBSV/UCBSV病毒分子育种新方法提供重要参考。