PPP/PRP对BM-MSCs生物学特性的影响

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目的:探讨贫血小板血浆(Platelet-poor plasma, PPP)和富血小板血浆(Platelet-rich plasma, PRP )对骨髓间充质干细胞( Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)生物学特性的影响,以此来完善BM-MSCs和不同浓度的血小板血浆之间的关系,同时为血小板血浆在临床疾病中的合理使用提供一部分理论依据。  方法:①本课题组实验过程中使用的血小板血浆均为单采血小板,购于镇江市中心血站;②采用全骨髓法分离培养SD大鼠BM-MSCs,用第三代大鼠BM-MSCs进行细胞形态学观察、表面抗原检测、成脂和成骨诱导分化等实验,从不同方面对BM-MSCs进行鉴定;③用MTT法检测PPP和PRP对BM-MSCs增殖能力的影响,通过0h-96h的浓度梯度筛选出 100×106个/ml、48h 作为后续实验的最适作用浓度和最适作用时间;用 MTT 筛选出来的最佳浓度处理BM-MSCs 48h后,显微镜下观察BM-MSCs形态学的变化;④用PLT浓度为100×106个/ml的PRP和同体积的PPP预处理BM-MSCs 48h后,分别进行平板克隆、细胞迁移、细胞侵袭以及 β-半乳糖苷酶染色等实验,检测不同浓度的血小板血浆对BM-MSCs 体外扩增能力、迁移能力、侵袭能力以及细胞衰老情况的影响;⑤利用 DAPI细胞核染色检测PLT浓度为100×106个/ml的PRP和同体积的PPP对BM-MSCs细胞核的影响;使用流式细胞分析仪检测 PLT 浓度为 100×106个/ml 的 PRP 和同体积的 PPP 对BM-MSCs 周期和凋亡的影响;在多向分化实验中,本课题组将实验分为以下三个组:对照(PPP)组、实验(PRP)组以及空白(DMEM)组,成骨分化和成脂分化分别诱导 21天后,对细胞进行茜素红染色和油红O染色,比较不同浓度血小板血浆处理后的BM-MSCs多向分化能力的改变;⑥通过免疫荧光实验和Western blot实验检测PLT浓度为100×106个/ml的PRP和同体积的PPP对BM-MSCs相关蛋白表达的影响。  结果:①本课题组培养出的SD大鼠BM-MSCs主要为长梭形或多边形,类似于成纤维细胞;流式细胞分析结果符合MSCs的表面标记:CD29、CD44和CD90的表达为阳性,而CD19、CD34、CD45、CD133和HLA-DR的表达为阴性;通过多向分化实验成功诱导出成脂细胞和成骨细胞;②MTT检测的结果表明在干预后第48h,PLT浓度为100×106个/ml的PRP处理后的细胞表现出更强的增殖活性;但是在72h和96h各组之间均无明显的差异;③迁移实验和侵袭实验结果显示,用PLT浓度为100×106个/ml的PRP处理BM-MSCs 48h后,BM-MSCs的迁移和侵袭能力明显增强;此外β-半乳糖苷酶染色结果表明实验(PRP)组的衰老细胞数比对照(PPP)组显著减少,统计分析表明各组之间的差异显著;平板克隆实验显示当PLT的浓度为100×106个/ml时,BM-MSCs的克隆形成能力明显增强;④分化能力:经PLT浓度为100×106个/ml的PRP和同体积PPP预处理过的BM-MSCs分别进行成骨诱导、成脂诱导以及细胞核染色等实验,成骨诱导和成脂诱导染色结果显示,实验(PRP)组 BM-MSCs 向成骨细胞分化的能力显著增强,但是向成脂细胞分化能力无明显改变;DAPI 细胞核染色结果表明,各组之间的差异不显著;⑤细胞周期实验和细胞凋亡实验结果与对照(PPP)组相比并无统计学差异,同样在细胞核的数目和形态上也未发生明显异常改变;⑥Western blot和免疫荧光的结果表明BM-MSCs干性相关蛋白(例如Sox2、Sall4、Oct4和Nanog等)的表达有不同程度的增高,此外,N-cadherin、Vimentin、α-SMA、PI3K、AKT、β-catenin等蛋白的表达升高,而E-cadherin和GSK-3β蛋白的表达降低。  结论:①在体外培养条件下,相对低浓度 (PLT≤100×106个/ml) 的PRP对BM-MSCs的形态学、体外扩增能力、迁移能力、侵袭能力、成骨分化能力和细胞衰老状况等方面均产生了显著的影响;②经PRP和PPP预处理过的BM-MSCs,其细胞周期、细胞凋亡、成脂分化能力和DAPI细胞核染色观察核染色质变化情况等方面未发现明显的改变。以上结果提示,在机体炎症或损伤情况下,BM-MSCs 可以归巢到这些炎症损伤部位,血小板的富集可能会对BM-MSCs产生一定的影响,从而有利于炎症的消除和损伤的修复。
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