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目的:胃癌是全球高发癌症类型之一,临床多数胃癌诊断时已经处于进展期,化疗作为进展期胃癌的主要治疗方法之一,因耐药性导致临床总体效果不甚理想,预后极差。因此迫切需要阐明肿瘤细胞的耐药发生机制,为逆转多药耐药提供新靶点。许多研究发现在肿瘤对抗化疗药物过程中自噬的增加可以缓解药物所引起的毒性作用,使肿瘤细胞产生耐药性。所以明确自噬途径变化机制可以增强肿瘤细胞的药物敏感性。转录因子Fox O3a活性的调控参与了细胞增殖、分化及应激反应等多个途径。在肿瘤研究中,Fox O3a平衡的紊乱导致细胞周期停滞和修复受损DNA的能力下降,促进肿瘤发生。研究显示化疗药物能够促进Fox O3a在细胞核中聚集诱导细胞凋亡。Circ RNAs是一类新的RNA分子,在不同肿瘤的化疗耐药中起重要作用。前期研究发现Fox O3a在调控细胞凋亡过程与自噬途径相关,Circ-Fox O3参与调控癌细胞增殖和存活。目前未见相关研究显示Fox O3a和circ-Fox O3是否参与胃癌细胞化疗耐药。因此,本课题旨在研究Fox O3a和circ-Fox O3协同自噬在胃癌化疗耐药中的作用机制,为临床胃癌耐药提供新的治疗靶点。方法:本研究以胃粘膜上皮细胞GES-1、人胃癌细胞株SGC7901及人胃癌耐药细胞株SGC7901/DDP为研究对象。采用CCK8法检测不同浓度的氯喹和顺铂分别给药后SGC7901及SGC7901/DDP的细胞活性变化。采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测给药前后细胞周期变化和凋亡比例。转染ATG7 si RNA至SGC7901/DDP细胞抑制自噬,与顺铂联合处理后检测细胞周期变化、凋亡比例及增殖活性。构建circ-Fox O3过表达和抑制表达质粒载体,使用Lipo3000转染至SGC7901/DDP细胞中,检测细胞周期变化、凋亡比例及增殖活性。通过RT-PCR方法检测给药和转染前后细胞系中circ-Fox O3、Fox O3a、PUMA和自噬通路相关基因的m RNAs水平。通过Western blot方法检测蛋白表达Fox O3a、p-Fox O3a、PUMA和自噬通路相关蛋白的表达。结果:1.检测发现与SGC7901相比,SGC7901/DDP中Fox O3a的蛋白表达上调,其中存在高表达p-Fox O3a蛋白,说明SGC7901/DDP中Fox O3a主要为失活状态。2.顺铂给药组SGC7901中Fox O3a与PUMA蛋白表达显著升高,而SGC7901/DDP细胞中未见明显改变。且检测发现两种胃癌细胞均存在基础自噬。3.进一步检测发现相比于对照组,顺铂给药后SGC7901/DDP中ULK1、ATG5和ATG7的蛋白表达水平明显增高,LC3-II的转化增多并且p62的降解被抑制。4.顺铂联合氯喹给药后较单独顺铂给药组细胞的凋亡率增加。SGC7901/DDP中Fox O3a蛋白的表达水平升高,p-Fox O3a表达有所下降,活化了Fox O3a的转录活性。5.使用ATG7 si RNA转染SGC7901/DDP细胞联合顺铂与单独顺铂给药组相比,增强了顺铂对SGC7901/DDP抑制能力,降低了顺铂单独使用所诱导的自噬相关蛋白表达,且Fox O3a和PUMA基因表达上调。6.对circ-Fox O3的研究发现,SGC7901/DPP细胞中的circ-Fox O3水平明显低于SGC7901和GES-1。7.顺铂给药后SGC7901中circ-Fox O3基因表达明显上调,SGC7901/DPP细胞circ-Fox O3略有上调。8.顺铂联合氯喹给药后SGC7901/DPP的凋亡敏感性增加,circ-Fox O3表达上调。9.与对照组相比,转染p SD1211/sh circ-Fox O3质粒抑制SGC7901/DDP中circ-Fox O3表达,通过加速G1/S转换而提高了细胞活力。10.与对照组相比,转染pc DNA3.1/circ-Fox O3质粒使SGC7901/DDP中circ-Fox O3过表达延缓了G1/S期细胞周期的进展,细胞周期停滞,细胞增殖被抑制。结论:自噬降低了胃癌耐药细胞对于药物诱导的凋亡敏感性。circ-Fox O3和Fox O3a的表达水平及活化形式在药物诱导细胞凋亡中发挥了重要作用。本课题研究发现抑制自噬可上调circ-Fox O3表达,减少Fox O3a的降解,调控凋亡相关细胞因子PUMA基因的表达。这些结果表明,存在自噬/circ-Fox O3/Fox O3a调节环在胃癌的化疗耐药中起关键作用,本课题研究结果揭示circ-Fox O3和Fox O3a可能是胃癌耐药患者的潜在治疗靶点。