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近年来,由苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)引起的苹果花脸病已上升为苹果生产中的主要病害。由于该病害直接造成果实花脸、锈果和畸形,大大降低了苹果的商品价值,造成了严重的经济损失。目前,该病害是生产中难以解决的问题。经调查发现,外界环境条件对苹果花脸病的发生程度有重要影响。因此,了解环境条件如何影响ASSVd在寄主中的积累和作用途径,有助于找到病毒防控的关键时期和有效措施。本研究首先明确了ASSVd在自然寄主苹果和草本寄主青帮油菜中增殖规律相似,因此,在青帮油菜上,通过荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)测定了温度、光照对ASSVd在寄主体内增殖的影响;通过RNA-seq技术分析了田间套袋和去除果袋(未套袋)苹果果皮中病毒积累量及病毒作用途径的差异;最后,利用RT-qPCR技术分析了同一罹病果实着色区域和未着色区域果皮病毒积累量的差异。
具体研究结果如下:
1.光照和温度对ASSVd在油菜植株体内增殖的影响
在草本寄主油菜和自然寄主苹果中ASSVd的增殖规律基本相同。草本寄主和自然寄主接种ASSVd1d后均扩散到整个植株,在各组织部位病毒积累量都为先增加再减少再增加的变化趋势,而且根部积累量都相对较高。因为木本植物不易接种,在田间也不易控制温度和光照,因此,采用草本寄主研究温度和光照对ASSVd在寄主体内增殖的影响。在一个月内不同环境条件下,病毒积累量的变化趋势没有发现明显规律,病毒积累量的高低有如下规律:7500Lux光照强度下,20℃培养的植株多数组织部位病毒积累量显著高于30℃;1500Lux的光照强度下,30℃培养条件下植株病毒积累量显著高于20℃。在温度为30℃情况下,强弱光照对各组织部位病毒积累的影响没有明显规律;20℃情况下,7500Lux光照下植株多数组织部位(除接种叶)病毒积累量显著高于1500Lux。
2.光照对果皮中ASSVd积累量及作用途径的影响
光照会促进果皮中ASSVd的增殖,ASSVd的增殖导致花脸病果实显症,并广泛影响了寄主中病毒的作用途径。KEGG分析表明主要包括代谢途径、次生代谢产物的生物合成、光合作用-天线蛋白途径。关于色素合成的关键途径包括:油菜素类固醇生物合成、类黄酮生物合成、类胡萝卜素的生物合成、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化途径。由三个方面表明GO富集分析的内容,生物过程方面来看,主要为代谢过程、细胞过程、生物调节过程、对刺激的反应。细胞成分方面来看,主要分布在细胞、膜、细胞器(叶绿体和类囊体)的部分,较少分布在质体、类囊体等。分子功能方面来看,主要为催化活性、结合、运输活动。KEGG分析得到的具有显著差异基因表达的通路,映射到GO分析得到的结果:细胞成分中的膜部分、生物过程中生物代谢过程和分子功能中的催化活性。
根据基因表达定量(FPKM>=1000)分析,套袋遮光处理会导致因ASSVd侵染表现上调的GT5(花青素3-O-葡萄糖基转移酶5)、ROMT(N-乙酰羟色胺O-甲基转移酶)、At3g50280(乙酰转移酶)、ANS(花青素双加氧酶)基因显著上调;套袋遮光处理会导致因ASSVd侵染下调的CSE(咖啡酰草酸酯酶)、ACT(类长春碱合成酶)基因显著下调;经过GSEA分析(|NES|>1,NOM p-val<0.05,FDR q-val<0.25),未套袋对比套袋罹病果实表现下调的差异基因主要为CHLG(叶绿素合酶)、CYP86A1(细胞色素合成)、叶绿素a-b结合蛋白相关基因(CAB13、CAP10A、CAB-151、CAB16、CAB8、CAP10A)、光系统蛋白(psbW、PSAK、PSBY)、类黄酮合成相关基因(CHLP、FLS)。
3.光照显症苹果着色和未着色区域ASSVd积累量的差异
为了探究不着色的果皮与着色果皮中病毒积累量的差异,取花脸症状的果实凸起着色的果皮和凹陷未着色的果皮,检测病毒积累量,发现未着色区域果皮中ASSVd积累量为着色区域果皮的4~40倍。
具体研究结果如下:
1.光照和温度对ASSVd在油菜植株体内增殖的影响
在草本寄主油菜和自然寄主苹果中ASSVd的增殖规律基本相同。草本寄主和自然寄主接种ASSVd1d后均扩散到整个植株,在各组织部位病毒积累量都为先增加再减少再增加的变化趋势,而且根部积累量都相对较高。因为木本植物不易接种,在田间也不易控制温度和光照,因此,采用草本寄主研究温度和光照对ASSVd在寄主体内增殖的影响。在一个月内不同环境条件下,病毒积累量的变化趋势没有发现明显规律,病毒积累量的高低有如下规律:7500Lux光照强度下,20℃培养的植株多数组织部位病毒积累量显著高于30℃;1500Lux的光照强度下,30℃培养条件下植株病毒积累量显著高于20℃。在温度为30℃情况下,强弱光照对各组织部位病毒积累的影响没有明显规律;20℃情况下,7500Lux光照下植株多数组织部位(除接种叶)病毒积累量显著高于1500Lux。
2.光照对果皮中ASSVd积累量及作用途径的影响
光照会促进果皮中ASSVd的增殖,ASSVd的增殖导致花脸病果实显症,并广泛影响了寄主中病毒的作用途径。KEGG分析表明主要包括代谢途径、次生代谢产物的生物合成、光合作用-天线蛋白途径。关于色素合成的关键途径包括:油菜素类固醇生物合成、类黄酮生物合成、类胡萝卜素的生物合成、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化途径。由三个方面表明GO富集分析的内容,生物过程方面来看,主要为代谢过程、细胞过程、生物调节过程、对刺激的反应。细胞成分方面来看,主要分布在细胞、膜、细胞器(叶绿体和类囊体)的部分,较少分布在质体、类囊体等。分子功能方面来看,主要为催化活性、结合、运输活动。KEGG分析得到的具有显著差异基因表达的通路,映射到GO分析得到的结果:细胞成分中的膜部分、生物过程中生物代谢过程和分子功能中的催化活性。
根据基因表达定量(FPKM>=1000)分析,套袋遮光处理会导致因ASSVd侵染表现上调的GT5(花青素3-O-葡萄糖基转移酶5)、ROMT(N-乙酰羟色胺O-甲基转移酶)、At3g50280(乙酰转移酶)、ANS(花青素双加氧酶)基因显著上调;套袋遮光处理会导致因ASSVd侵染下调的CSE(咖啡酰草酸酯酶)、ACT(类长春碱合成酶)基因显著下调;经过GSEA分析(|NES|>1,NOM p-val<0.05,FDR q-val<0.25),未套袋对比套袋罹病果实表现下调的差异基因主要为CHLG(叶绿素合酶)、CYP86A1(细胞色素合成)、叶绿素a-b结合蛋白相关基因(CAB13、CAP10A、CAB-151、CAB16、CAB8、CAP10A)、光系统蛋白(psbW、PSAK、PSBY)、类黄酮合成相关基因(CHLP、FLS)。
3.光照显症苹果着色和未着色区域ASSVd积累量的差异
为了探究不着色的果皮与着色果皮中病毒积累量的差异,取花脸症状的果实凸起着色的果皮和凹陷未着色的果皮,检测病毒积累量,发现未着色区域果皮中ASSVd积累量为着色区域果皮的4~40倍。