研究背景和目的：食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类健康。世界范围内食管癌的发病率和致死率在常见癌症中分别排第8位和第6位。食管癌也是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在我国恶性肿瘤中居第四位,鳞癌最多,约占90%。食管癌各期的治疗手段各异,手术是早期食管癌的首要治疗手段,但是术后复发率很高,而且大部分患者发现诊断时已属于中晚期,常常失去手术的机会,因此寻找更有效的非手术治疗食管癌的方法是当务之急。随着光敏剂及照光系统的发展,光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)在食管癌尤其是早期食管癌及癌前病变如Barret食管的治疗上已取得较大进展。早期患者甚至可治愈,而对于中晚期患者,则不仅可明显改善其临床症状(如食道梗阻),而且可明显延长其中位生存期。目前,光动力治疗已经被证实是食管癌的一种有前景的治疗模式。肿瘤光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)是利用光敏剂分子接受光照后产生多种活性氧物质(reactive oxygen species, ROS),使细胞结构和功能受到损伤,而导致细胞凋亡的一种独特的肿瘤治疗方法。PDT三要素由激光、光敏剂和分子氧所组成,其中任何单独一项对细胞都是无害的。但联合应用几种成份便会产生强烈的细胞毒性。光动力反应生成活性氧成分(reactive oxygenspecies,ROS)实现对目标组织的选择性损伤。跟传统的化学疗法、手术疗法和放射疗法相比,PDT有若干潜在的优势：相对的非侵入性治疗；可以准确定位目标肿瘤组织；无总剂量限制可以重复给药；整个治疗过程不会或只带来很小的疤痕；操作相对方便并且副作用很小等。由于肿瘤组织对光敏剂有选择性滞留的特点,使得PDT的反应局限于肿瘤组织,不对周围正常组织造成影响,并不破坏病变器官的完整性和连续性。近年来,随着PDT在肿瘤临床治疗的深入研究,光动力疗法有望成为继手术、放疗和化疗而后的第四种特殊类型的肿瘤治疗方法。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种跨膜糖蛋白,是蛋白激酶超家族的成员之一。它由1186个氨基酸残基构成,分子量为170kD的一种跨膜糖蛋白。EGFR主要位于细胞质膜上,属于Ⅰ型酪氨酸激酶受体亚族,具有酪氨酸激酶的活性。该蛋白作为表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)家族成员的受体,能够与EGF等配基相结合并激活下游细胞内信号转导通路。这些通路的激活最终会导致细胞的增殖、逃避凋亡及癌细胞浸润和转移。在恶性肿瘤中,EGFR的过度表达,可持续向细胞内传递分裂增殖信号,干扰细胞分化的正常调控状态,导致细胞持续增殖,发生恶性转化。EGFR的高度表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和远处转移。在众多EGFR细胞内信号转导通路中,PI3K/Akt通路是其中最重要的通路之一。EGFR与配体结合后发生活化,可激活其下游PI3K/Akt信号传导通路,发挥其调控细胞增殖、抗凋亡等作用。EGFR稳定的表达于多种上皮组织,以及间质和神经源性组织。不同器官发生的实体瘤也高表达EGFR,如头颈部癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌等。EGFR在肿瘤中的高度表达及其在肿瘤细胞生长、分化中起着重要作用的这些特点,使EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和治疗的靶点。随着食管癌恶性程度及浸润转移的增加,EGFR基因蛋白表达逐渐增强；EGFR可作为监测食管癌早期发生,预测转移潜能和预后状况的有价值的指标；并以此提出新的治疗策略。PI3K/Akt信号通路与肿瘤的相关性近年来备受瞩目,PI3K/Akt信号通路不仅导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附和细胞外基质的降解密切相关。PI3K/Akt信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡,促进细胞周期进展,从而促进细胞的生存和增殖,同时参与血管形成,传递整合素所介导的侵袭信号在肿瘤的形成以及增殖转移中扮演重要角色。PI3K/Akt通路是EGFR信号传导通路的主要下游通路之一,被认为是癌细胞存活的首要通路,有“抗凋亡途径”之称。PI3K通过调节亚基中的SH2区域和受体相互接触,导致催化亚基的异构性激活。随着PI3K的激活,二磷酸磷脂酰肌醇——PI3K的脂质底物,在质膜的内面转变为第二信号三磷酸磷脂酰肌醇。三磷酸磷脂酰肌醇和含有PH区域的蛋白结合,导致这些蛋白构象的改变。磷酸化结合的PH区域存在于大多数的蛋白中,可促进其下游分子Akt/蛋白激酶B的磷酸化,最大限度地激活Akt;Akt是信号转导途径中重要蛋白激酶,其为PI3K下游的靶蛋白,是PI3K/Akt信号转导通路的核心,其持续活化与肿瘤的发生发展密切相关。PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等,从而调节细胞的增殖、分化、凋亡。作为细胞内重要的抗凋亡信号通路,PI3K/Akt的活性受到多种因素的影响,其中PTEN通过使PIP3脱磷酸化为PIP2而成为PI3K/Akt信号转导通路的主要负性调节因子。5-氨基乙酰丙酸是一种二代光敏剂,已于2000年被美国FDA批准用于临床实验治疗。它是一种内源性光敏剂,是活细胞血红素的前体,本身无光动力效应,在体内经一系列酶的作用可产生在光动力治疗中发挥光敏剂作用的血卟啉-IX。这种光敏剂相比Photofrin其光毒性持续时间较短(大约24小时),远远短于现在临床广泛应用的Photofrin。本课题选择ALA作为光敏剂,通过研究ALA-PDT对食管癌EGFR/PI3K/Akt通路一些相关基因及蛋白的变化以探讨光动力对EGFR信号通路的主要作用机制；通过研究克隆形成率的不同以初步探讨ALA-PDT对食管癌细胞增殖的影响方法：第一章ALA-PDT对食管癌细胞增殖的影响了解对Eca-109细胞的克隆增殖比率,计算克隆形成率：实验分为对照组和ALA-PDT组。治疗组细胞给予ALA(终浓度为0.25mM)孵育6小时后进行于630nm Diomed光动力治疗系统下进行光照(功率200mW/cm2,照光150s,光剂量30J/cm2)。取对数生长期的两组细胞,按每孔100个接种于6孔板,每组3个复孔。吹打细胞使其分散均匀。常规静止培养细胞2w取出观察,细胞已形成克隆,弃培养液。常规固定、姬姆萨染色,清洗,计数>50个细胞的克隆数,求均值,除以接种细胞数,求克隆形成数。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。统计分析：所有数据采用spss13.0统计软件进行统计处理。实验结果以“均数±标准差”表示。对照组与治疗组之间克隆形成率的差异分析均采用独立样本t检验。P值<0.05时其差异有统计学意义。第二章ALA-PDT对食管癌细胞EGFR信号通路的影响实时定量PCR法检测EGFR、PI3K、Akt的基因表达变化：实验分为对照组和ALA-PDT组。治疗组细胞给予ALA(终浓度为0.25mM)孵育6小时后于630nm Diomed光动力治疗系统下进行光照(功率200m W/cm2,照光150s,光剂量30J/cm2)。于光照后24 h收集细胞,并提取细胞总RNA,逆转录为cDNA后采用SYBR荧光定量试剂于ABI7500 PCR仪上检测的EGFR、PI3K、Akt基因表达变化情况。Western Blotting法检测EGFR、PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量的变化：实验分为对照组和ALA-PDT组。治疗组细胞给予ALA(终浓度为0.25mM)孵育6小时后进行于630nm Diomed光动力治疗系统下进行光照(功率200m W/cm2,照光150s,光剂量30J/cm2)。于光照后24 h收集细胞,并提取细胞总蛋白,采用Western Blotting法检测EGFR、PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量的变化。统计分析：所有数据采用spss13.0统计软件进行统计处理。实验结果以“均数±标准差”表示。对照组与治疗组之间基因及蛋白表达相对量的差异分析均采用独立样本t检验。P值<0.05时其差异有统计学意义。结论：第一章ALA-PDT对食管癌细胞增殖的影响平板克隆形成试验显示14天后对照组三个孔形成的克隆数分别为66、56、53个/孔,克隆形成率为58.33±6.81%,PDT处理组三个孔形成的克隆数分别为31、29、27个/孔,克隆形成率为29.00±2.00%。ALA-PDT组的克隆形成率降低,与对照组相比,其差异具有统计学意义(t=7.161,P=0.002)。结果表明ALA-PDT能显著抑制食管癌细胞的增殖。第二章ALA-PDT对食管癌细胞EGFR信号通路的影响1.EGFR、PI3K、Akt在ALA-PDT作用于Eca-109细胞24h后其表达均显著下调,且与对照组相比,其差异均有统计学意义(t=9.623,P=0.011；t=27.392,P=0.001；t=28.315,P=0.001)。2. EGFR、PI3K、p-Akt蛋白在ALA-PDT作用于Eca-109细胞24h后其表达均显著下调,且与对照组相比,其差异均有统计学意义(t=5.323,P=0.006；t=4.73,P=0.009；t=5.026,P=0.007；t=7.871,P=0.001)。Akt蛋白表达轻微下调,但与对照组相比其差异无统计学意义(t=0.109,P=0.918)。结果表明EGFR/P13K/Akt是PDT治疗食管癌细胞的凋亡通路之一。