吸烟对人体健康的危害已众所周知。据统计,每年因为吸烟造成的死亡人数可达250万人之多,吸烟已成为人们所公认的危害人体健康极其重要的因素。相关研究表明,吸烟会导致机体内巨噬细胞的堵塞,使巨噬细胞吞噬及迁移的能力降低,从而降低机体抗感染的能力。巨噬细胞作为人体的免疫细胞,参与人体多种疾病的发病过程,因此近年来巨噬细胞也被作为疾病治疗的主要靶标,研究者们试图通过对其功能的调控,使病情得到改善。细胞膜受体蛋白Integrins通过与胞内骨架蛋白的相互作用来介导细胞与胞外基质的黏着,参与了细胞的迁移及吞噬过程。因此本课题旨在通过研究尼古丁对巨噬细胞的功能、整合蛋白Integrins及细胞外间充质蛋白FNs家族蛋白在巨噬细胞中的表达的影响,试图阐明影响巨噬细胞功能的相关分子机制,为巨噬细胞相关疾病的预防和治疗提供一个细胞活体水平的重要资料。本课题以原代巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264两种细胞培养模型为研究对象,利用尼古丁对细胞进行药物干预,通过高内涵活细胞成像分析系统在活细胞水平上检测尼古丁对巨噬细胞形态及功能方面的影响;采用免疫荧光染色、扫描电镜对Integrins蛋白及FNs蛋白进行定位分析;利用广谱试剂盒检测多种整合素蛋白在细胞表面的表达结合;Elisa方法检测分析在RAW264细胞中不同的Integrins与FN-α蛋白间的相互作用;通过Western Blot技术从蛋白水平检测尼古丁对Integrins蛋白和FNs蛋白在巨噬细胞中表达的影响;利用实时荧光定量PCR方法从mRNA水平检测Integrins蛋白在巨噬细胞中的表达。结果显示如下:(1)高内涵分析结果显示:在常规培养皿上,尼古丁使原代巨噬细胞的运动速度及距离降低,长度和面积减小,运动角度发生变化;在ECM基质环境中,原代巨噬细胞的面积及长度在尼古丁处理后增大,运动的距离减小,细胞运动的速度在不同的作用时间存在一定的差异;小鼠巨噬细胞系RAW264细胞的面积、长度、运动速度及距离均在尼古丁作用不同时间之间存在显著差异。原代巨噬细胞和RAW264细胞的运动转角在ECM培养环境中均无显著性差异。(2)免疫荧光及扫描电镜结果显示:Integrins蛋白呈点状分布在巨噬细胞的伪足,FN-α蛋白也呈点状分布在细胞的迁移轨迹及细胞的伪足上。该两种蛋白具有一定的共定位现象,在尼古丁作用后,Integrinβ1、Integrinαv及FN-α蛋白的表达量均有一定程度的减少。(3)Integrins及FNs表达模式检测结果显示:在RAW264细胞中,Integrin α2、Integrin α5、Integrin β1及Integrin β2四种蛋白具有一个相对较高的表达量,且Alpha Integrin 和 Beta Integrin 存在一定程度的相关性。而 Integrin α3、Integrin α5、Integrinβ1和Integrin β4该四种蛋白与FN-α蛋白具有一个较强的相互作用。(4)WesternBlot结果表明:在尼古丁作用36h时,Integrinβ1蛋白呈显著的上调,到72 h逐渐下调;Integrin αv蛋白在尼古丁作用0 h到36 h逐渐下调,48 h时呈显著上调;FN-3蛋白在尼古丁作用24 h时表达量下调;FN-4蛋白在24 h和48 h时表达量上调,72 h后显著下调;FN-F蛋白在尼古丁作用24 h时呈显著的下调,之后表达量相对稳定,72 h后又下调。(5)实时荧光定量PCR结果显示:Integrin β1蛋白在尼古丁作用24 h和48 h时表达量上调,72h后下调(P<0.001);Integrinαv蛋白在24h和36h时表达量上调,之后趋于稳定。结论:本课题利用高内涵活细胞成像分析系统、免疫荧光染色技术、扫描电镜技术、Integrins表达模式检测、Elisa、Western Blot和实时荧光定量PCR方法从细胞、蛋白及mRNA水平上探讨尼古丁对巨噬细胞行为及功能的影响,以及Integrins和FNs两种蛋白在巨噬细胞中功能改变的作用机制。结果表明该两种蛋白可能参与调控巨噬细胞的迁移过程,并具有一定的相关性,可为巨噬细胞相关疾病的治疗提供细胞水平的重要资料。