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青石斑鱼是海水养殖鱼类中最具经济价值的名贵鱼类之一。用大肠杆菌脂多糖(LPS)刺激青石斑鱼(剂量为40 mg/kg体重),24 h后取各种组织保存。应用SMART技术合成青石斑鱼受脂多糖刺激前、后脾脏的SMART cDNA,用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了青石斑鱼脾脏差异表达基因的cDNA文库。看家基因微管蛋白被消减了1024倍,这说明本文库具有较高的消减效率。从消减文库中随机挑取克隆进行PCR筛选,测序得到209个EST,组装后获得92个unique gene。把这些基因提交到GenBank数据库,注册编号为B410743-EB410834。用BLASTX程序在GenBank等数据库中进行序列比对并根据结果对所得基因进行注释,其中34个有明确的注释,3个与已知但未描述功能的基因相似,55个是未知的。用RT-PCR检测8个基因在注射了脂多糖的青石斑鱼和正常青石斑鱼脾脏中的表达情况,结果表明其中7个基因在受脂多糖刺激后的青石斑鱼脾脏中的表达量均高于对照青石斑鱼。在筛选青石斑鱼脾脏SSH cDNA文库时鉴定出抗细胞凋亡因子DAD1并用RACE-PCR方法获得它的全长cDNA。该基因cDNA全长为721 bp,开放阅读框长342 bp,编码113个氨基酸。青石斑鱼DAD1推测的氨基酸序列与斑马鱼DAD1序列的同源性为86%,与人、家鼠、牛DAD1序列的同源性均为84%。半定量RT-PCR结果显示：DAD1在正常的青石斑鱼和注射了脂多糖的青石斑鱼脾、心、头肾、肾、肝中都有转录,在脾、肝中表达水平较高,心、头肾、肾次之,而在肌肉中未见明显表达。DAD1在注射了脂多糖的青石斑鱼各组织中的表达量均高于正常青石斑鱼,这提示LPS可能是DAD1基因表达的刺激剂。用RACE-PCR方法从青石斑鱼脾脏消减文库中克隆到同种移植炎症性因子AIF-1。该基因cDNA全长为1102 bp,开放阅读框长444 bp,编码147个氨基酸,预测分子量为16.6 KDa。青石斑鱼AIF-1推测的氨基酸序列与真鲷、河豚、人、家鼠AIF-1序列的同源性分别为84%、82%、66%和64%。用半定量RT-PCR检测AIF-1基因在青石斑鱼不同组织中的mRNA转录水平,结果显示：AIF-1在正常的青石斑鱼的脾、心、’肾中均有转录。在受到脂多糖刺激后,AIF-1在青石斑鱼脾、头肾和肝中的表达量显著增加,这提示青石斑鱼AIF-1可能在免疫系统中发挥着作用。构建青石斑鱼AIF-1与His-tag融合表达的载体并转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析结果显示：在16.6 kD处产生特异性的表达条带。用His-tag亲和层析柱纯化AIF-1蛋白并制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价、鉴定抗原性,结果表明AIF-1多克隆抗体具有较高的效价。Western印迹分析验证了AIF-1在大肠杆菌中的正确表达。用RACE-PCR方法从青石斑鱼脾脏SSH cDNA文库中克隆到G蛋白信号转导调节因子RGS16。该基因cDNA全长为700 bp,开放阅读框长537 bp,编码178个氨基酸,预测分子量为20.5 KDa。青石斑鱼RGS16推测的氨基酸序列与斑马鱼、家鼠、人、牛RGS16序列的同源性分别为61%、49%、48%和47%。用RT-PCR方法研究RGS16基因在正常青石斑鱼和注射了脂多糖的青石斑鱼各组织中的表达情况,结果显示：RGS16仅在正常的青石斑鱼脾脏中有表达,而注射了脂多糖后,RGS16在青石斑鱼的脾、心、头肾、肾和肝中均有转录,其中在脾、肝中表达水平较高,而在肌肉中未见明显表达。构建青石斑鱼RGS16与His-tag融合表达的载体,在大肠杆菌中进行表达。纯化RGS16并制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价、鉴定抗原性,结果表明RGS16多克隆抗体具有较高的效价。应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达出青石斑鱼RGS16蛋白,Western印迹分析验证了RGS16在大肠杆菌和昆虫细胞中的正确表达。这些差异表达基因的克隆和表达为研究青石斑鱼的免疫系统提供了新的线索,有利于彻底阐明其发挥功能的生物学机制。