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目的:探讨微嵌合耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cells,tolDC）干预胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis,CIA）是否与改变大鼠免疫检查点分子表达有关,生物信息学分析寻找免疫检查点分子参与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）发病的证据。方法:1.制备大鼠骨髓来源tolDC:（1）提取雌性SD大鼠骨髓来源的单核细胞,用细胞因子诱导单核细胞成为DC,同时加入核因子-κB寡核苷酸诱骗剂（nuclear factor-kappa B oligodeoxynucleotide decoy,NF-κB ODN Decoy）进行处理,以诱导DC转化为tolDC。（2）细胞实验分为4组。Control DC组（仅加细胞因子）、Decoy DC组（细胞因子加NF-κB ODN Decoy）、LPS-DC组（细胞因子加脂多糖）及LPS-Decoy DC组（细胞因子加NF-κB ODN Decoy和脂多糖）。用倒置显微镜对培养至第6天的细胞进行形态学观察并收获细胞,流式细胞术检测OX-62以评估DC纯度,检测CD80和CD86以评估DC成熟度。2.建立CIA模型并评估tolDC干预CIA的效果:实验动物为正常雌性SD大鼠,动物实验设为3组,CIA组:在第0天和第14天注射牛Ⅱ型胶原（bovine collagen typeⅡ,BⅡC）乳剂建立CIA模型,在第21天静脉注射磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）。正常对照组:相同时间点注射等量PBS。tolDC组:在第0天和第14天注射BⅡC乳剂建立CIA模型,第21天静脉注射约5×10~6个负载了特异性抗原BⅡC的Decoy DC悬液。在初次免疫的第0、7、14、21、28、35天,对各组大鼠进行关节炎指数评分。第35天处死大鼠,留取肠系膜淋巴结和注射足踝关节制成石蜡切片。对踝关节切片进行HE染色以评估各组大鼠组织病理变化。3.多色免疫荧光染色检测大鼠免疫检查点分子:基于课题组前期研究成果:tolDC在肠系膜淋巴结和关节等部位形成微嵌合,因此选择肠系膜淋巴结和踝关节用以检测总计8个免疫检查点分子（PD1、PDL1、CD40、CD40L、CTLA4、CD28、CD80和CD86）。（1）肠系膜淋巴结石蜡切片进行免疫组织化学染色以验证抗体有效性及确定抗体浓度。（2）多色免疫荧光染色预实验确定抗体与荧光的最优搭配并对检测条件进行优化。8个免疫检查点分子根据配对原则分为两组,panel 1:PD1、PDL1、CD40和CD40L,panel 2:CTLA4、CD28、CD80和CD86。每张肠系膜淋巴结切片标记4个抗体,并测试与不同荧光搭配的效果,直到找到抗体与荧光的最佳搭配,使整体的染色效果最优。（3）在正式染色中,依据预实验确定的实验条件,对肠系膜淋巴结进行4标染色,对踝关节进行双标染色并进行定量分析。4.生物信息分析寻找免疫检查点分子与RA的关系:从GEO数据库下载基因芯片数据集GSE55235的原始数据和平台注释文件。GSE55235数据集总共检测了10名RA患者和10名正常对照的基因表达谱。用affy包对原始数据预处理后,对各样本的基因表达值绘制箱线图并进行主成分分析（principal component analysis,PCA）用以评估数据标准化的效果和芯片数据的质量。最后分析免疫检查点分子在RA患者和正常对照之间的差异表达以便进一步验证免疫检查点分子在RA发病中的作用。结果:1.tolDC的性能评价:倒置显微镜下可见各组细胞间具有毛发样突起的成熟DC有较大差异,Decoy DC组较少见到毛发样突起细胞,而Control DC组可见较多突起细胞。LPS-DC组中毛发样突起细胞最多,并且突起多而粗。与LPS-DC组相比,LPS-Decoy DC组中毛发样突起细胞较少。流式细胞术显示,各组细胞OX-62阳性率均＞95%,差异无统计学意义（P＞0.05）,然而Decoy DC组CD80、CD86的阳性率及平均荧光强度均低于Control DC组（P＜0.05）;LPS-Decoy DC组CD80、CD86的阳性率及平均荧光强度均低于LPS-DC组（P＜0.05）。2.tolDC对CIA的干预效果:相比于正常对照组,CIA组关节炎指数明显升高（P＜0.05）;与CIA组相比,tolDC组在第28天和第35天关节炎指数评分明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。踝关节病理结果显示,与正常对照组相比,CIA组大鼠踝关节病理损伤明显加重;与CIA组相比,tolDC组大鼠踝关节病理损伤明显减轻。3.微嵌合tolDC对CIA大鼠免疫检查点分子的影响:与正常对照组相比,刺激性免疫检查点分子CD28、CD80、CD86、CD40和CD40L在CIA组大鼠肠系膜淋巴结和踝关节中表达增多（P＜0.05）,抑制性免疫检查点分子PD1和CTLA4在CIA组大鼠肠系膜淋巴结中表达增多,PD1在CIA组大鼠踝关节表达增多（P＜0.05）。与CIA组相比,CD86和CD40在tolDC组大鼠肠系膜淋巴结中表达减少（P＜0.05）,CD40、CD40L、CD28、CD80和CD86在tolDC组大鼠踝关节中表达减少（P＜0.05）,抑制性免疫检查点分子PDL1在肠系膜淋巴结中表达上调（P＜0.05）,PD1、PDL1和CTLA4在tolDC组大鼠踝关节中表达增多（P＜0.05）。4.标准化后的各样本基因表达值的中位数值分布在中点并且不同样本的中位线处于同一水平位置。PCA分析结果显示RA组各样本距离较近并聚集成团,NC组样本同样距离较近且聚集在一起。RA组和NC组之间能很好的区分开。刺激性免疫检查点分子CD28、CD86、CD40、CD40L、ICOS、CD70和CD27在RA组中表达明显增多。抑制性免疫检查点分子PDL2、LAG3和CD200在RA中表达也明显增多。结论:微嵌合tolDC可能通过改变大鼠肠系膜淋巴结和踝关节中免疫检查点分子的表达从而起到减轻关节炎症的作用;生物信息分析结果与实验结果大致相同,提示免疫检查点分子的异常表达可能和RA的发病有关。